陳燕惠 盧洪珠 鄭 杰 章飛霞 林曉霞

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院兒科，福州 350001）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）改變與GC受體（glucocorticoid receptor，GR）表達(dá)異常，與行為異常如注意缺陷多動(dòng)障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）、情緒改變、認(rèn)知行為關(guān)系密切[1-2]。已有研究表明，GC 能夠通過(guò)多種途徑影響五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、多巴胺（dopamine，DA）等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)[3-4]。單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAO A）是單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)鍵降解酶之—，能夠直接調(diào)控5-HT、NE、DA 的水平[5-8]。GC-GR 復(fù)合物能夠與MAO A 啟動(dòng)子中的GC 反應(yīng)元件（glucocorticoid response elements，GRE）結(jié)合，促進(jìn)MAO A 基因的表達(dá)。MAO A 啟動(dòng)子區(qū)存在Sp 結(jié)合位點(diǎn)，能夠與Sp1 Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合。GC可增加Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子-11（transcription factor Krüppel-like factor 11，KLF11）的mRNA 及蛋白水平，過(guò)表達(dá)的KLF11 可增加MAO-A 的mRNA 水平及其活性[9-10]。提示GC/GR 可能通過(guò)KLF11、Sp1 與MAO A 發(fā)生交互作用。本課題擬探究GR 激動(dòng)劑、抑制劑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞KLF11、Sp1和MAO A 表達(dá)的影響，及GR 與MAO A 交互作用的可能通路，以期為揭示ADHD 的發(fā)病機(jī)制和治療新途徑提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生48 h 內(nèi)SD 乳鼠24 只（清潔級(jí)，由福州吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。大鼠實(shí)驗(yàn)前均置于潔凈環(huán)境中自由進(jìn)食飼料和飲用自來(lái)水，室溫控制于23℃±2℃，濕度保持在約56%，12 h 間斷照明，24 h 定期進(jìn)行紫外殺菌消毒和排風(fēng)，避免強(qiáng)光和強(qiáng)聲刺激。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)

SD 乳鼠75%乙醇消毒，用乙醚吸入麻醉后斷頸處死，分離出前額葉，于37℃培養(yǎng)箱中消化25 min，接種于1%多聚賴(lài)氨酸預(yù)包被的6 孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。前額葉神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，觀(guān)察其神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)并拍照。換液后，根據(jù)添加藥物來(lái)分組，前額葉神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分為DEX 組、米非司酮（mifepristone，RU486）組、對(duì)照組3 組。DEX 組將2 μL 100×103nmol/L DEX 溶液加入含2 mL 神經(jīng)元專(zhuān)用培養(yǎng)基的6 孔板中，使DEX 終濃度為100 nmol/L；RU486 組則將20 μL100 μmol/L RU486 溶液加入含2 mL 神經(jīng)元專(zhuān)用培養(yǎng)基的6 孔板各孔中，使RU486 終濃度為1 μmol/L；對(duì)照組的各孔加入20 μL 相同溶劑干預(yù)。各組神經(jīng)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 KLF11、Sp1 和MAO A 表達(dá)測(cè)定

KLF11（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）單克隆抗體按照1∶500 稀釋?zhuān)豢筍p1（Cusabio 公司）和MAO A（美國(guó) Abcam 公司）均1∶100 稀釋?zhuān)勒者~新KIT 9706 超敏免疫組織化學(xué)試劑盒操作說(shuō)明，孵育一抗及生物素化二抗，DAB 染色3 min，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片，呈現(xiàn)棕黃色部分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 圖像分析

各個(gè)組別的玻片于普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，并拍攝結(jié)果。先在10 倍×10 倍下定位，每張玻片40倍×10 倍下隨機(jī)取5 個(gè)不重疊視野，利用 Image-Pro-Plus 6.0 圖像分析軟件分別分析GR 平均積分光密度值（mean optical density，MOD= IOD SUM/AREA SUM），前額葉神經(jīng)細(xì)胞KLF11、Sp1和MAO A 免疫細(xì)胞化學(xué)顯色的累積光密度值，結(jié)果取均值。所有組別光密度值的測(cè)量均在相同的光學(xué)環(huán)境下完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以±s表示。使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，兩組均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，其中Sp1和 MAO A累積光密度值符合雙變量正態(tài)分布，相關(guān)性分析用Pearson 相關(guān)分析，以上分析檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用軟件GraphPad Prism 6.02進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 前額葉神經(jīng)細(xì)胞KLF11 表達(dá)

與對(duì)照組（0.108±0.01）比較，DEX 可明顯提高KLF11 的表達(dá)（0.139±0.01）（P<0.05），RU486 對(duì)KLF11 的表達(dá)（0.124±0.00）也有促進(jìn)作用（P<0.05），但較DEX 低（P<0.05）（圖1）。

圖1 各組前額葉區(qū)神經(jīng)細(xì)胞KLF11 表達(dá)結(jié)果，免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×200。A：對(duì)照組；B：DEX 組；C：RU486 組.

2.2 前額葉神經(jīng)細(xì)胞Sp1 和MAO A 表達(dá)

結(jié)果顯示（表1），Sp1 表達(dá)水平DEX 組較對(duì)照組明顯增高（P<0.01）；RU486 組Sp1 表達(dá)水平較對(duì)照組降低（P<0.05）。MAO A 的表達(dá)水平DEX 組比對(duì)照組顯著增多（P<0.01）；RU486 組較對(duì)照組MAO A 表達(dá)水平降低（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組前額葉區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Sp1（A1～C1）和MAO A（A2～C2）表達(dá)結(jié)果，免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×400。A：對(duì)照組；B：DEX 組；C：RU486 組.

表1 前額葉區(qū)各組細(xì)胞Sp1 和MAO A累積光密度（IOD）值（n=8，±s）

表1 前額葉區(qū)各組細(xì)胞Sp1 和MAO A累積光密度（IOD）值（n=8，±s）

*P<0.05，**P<0.01 vs 對(duì)照組

組別Sp1MAO A對(duì)照組65 206.02±2 447.9342 667.57±2 335.32 DEX 組84 966.93±3 017.35**74 601.66±3 346.72**RU486 組56 166.81±1 625.73*36 218.07±2 912.10*

2.3 前額葉神經(jīng)細(xì)胞Sp1 和MAO A 表達(dá)相關(guān)性分析

前額葉神經(jīng)細(xì)胞Sp1 和MAO A 的累積光密度值統(tǒng)計(jì)學(xué)資料均符合雙變量正態(tài)分布，相關(guān)分析顯示r=0.965，兩者呈正相關(guān)（P<0.01）（圖3）。

圖3 前額葉神經(jīng)細(xì)胞Sp1 和MAO A 累積光密度值散點(diǎn)圖和相關(guān)關(guān)系

3 討論

近年研究表明，ADHD 患者存在與下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA 軸）密切相關(guān)的應(yīng)激時(shí)GC 反應(yīng)遲鈍，GC 覺(jué)醒反應(yīng)低下及日間血清GC 水平低下，GC 水平/知覺(jué)壓力比率較高等特征[11-12]。單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)在A(yíng)DHD 發(fā)病中發(fā)揮重要作用[13]。

MAO 是單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)最主要的降解酶，該基因缺陷導(dǎo)致的Brunner 綜合癥患者存在A(yíng)DHD 樣表現(xiàn)如沖動(dòng)、睡眠障礙、低智商等[14-15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明長(zhǎng)期暴露于DEX 可以表現(xiàn)出劑量依賴(lài)的前額葉區(qū)MAOA 及MAOB 的活性增加及5-HT 周轉(zhuǎn)率增加[16]。Manoli 等[17]報(bào)道在人類(lèi)骨骼肌細(xì)胞中，GC 能促進(jìn)MAO A 基因和蛋白的表達(dá)，并存在劑量和時(shí)間效應(yīng)，而GR 抑制劑RU486 或Sp1 結(jié)合位點(diǎn)的阻滯劑光神霉素會(huì)影響MAO A mRNA 的表達(dá)。

MAO A 的水平在轉(zhuǎn)錄及分解代謝等環(huán)節(jié)接受多種途徑的調(diào)控。MAO A 的轉(zhuǎn)錄涉及轉(zhuǎn)錄因子SP1、KLF11，自噬相關(guān)的經(jīng)典通路SIRT1-FOXO1等[18]。其中KLF11 屬于Sp1 Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子家族，是一種啟動(dòng)或關(guān)閉基因組其他基因的角色“主要調(diào)節(jié)子”，在體內(nèi)廣泛表達(dá)并通過(guò)在啟動(dòng)子區(qū)域綁定不同的序列，觸發(fā)RNA 聚合酶Ⅱ調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始[19]。KLF11 能結(jié)合MAO A 啟動(dòng)子進(jìn)而促進(jìn)MAO A 表達(dá)，抑郁癥及慢性壓力能夠誘導(dǎo)前額葉KLF11-MAO A 通路的異常，該通路在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用[19]。

GR 功能是否受KLF11-MAO A 通路介導(dǎo)而影響MAO A 表達(dá)？本研究應(yīng)用GR 抑制劑觀(guān)察其對(duì)前額葉原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞KLF11 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示RU486 也能提升KLF11 的表達(dá)，盡管RU486對(duì)KLF11 表達(dá)的促進(jìn)作用較DEX 為低。提示GR抑制劑RU486 對(duì)MAOA 表達(dá)的影響可能還涉及其他調(diào)節(jié)通路。

Sp1 是Sp/KLF 家族26 個(gè)成員中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，幾乎存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，和許多蛋白質(zhì)存在交互作用，包括其他轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體、調(diào)節(jié)因子等，能增強(qiáng)目的基因的調(diào)節(jié)功能[20]。Sp1 結(jié)合于細(xì)胞基因啟動(dòng)子區(qū)富含GC 序列和Sp1 結(jié)合位點(diǎn)處。GR 通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Sp1 間接作用于MAO A 的Sp1 結(jié)合位點(diǎn)，4 個(gè)Sp1 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合到Sp1 上對(duì)MAO A 的活性和蛋白表達(dá)影響不同，第3 個(gè)Sp1 結(jié)合位點(diǎn)影響最大。過(guò)表達(dá)的Sp1 可增強(qiáng)MAO A 啟動(dòng)子的活性，siRNA 介導(dǎo)的Sp1 水平降低抑制內(nèi)源性MAO A 啟動(dòng)子活性和表達(dá)水平，其機(jī)制涉及Sp1 和cAMP 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，提示GC/GR 可能通過(guò)Sp1 與MAO A 有交互作用[21]。本研究結(jié)果顯示原代培養(yǎng)前額葉和海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞予以GR 激動(dòng)劑DEX、GR 抑制劑RU486 干預(yù)后，不論是前額葉還是海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Sp1 的累積光密度值DEX 組比對(duì)照組顯著增多，RU486 組較對(duì)照組Sp1表達(dá)水平降低，提示GR 激動(dòng)劑可以提高Sp1 的表達(dá)水平。

研究提示GR 和Sp1 對(duì)于GC 誘導(dǎo)的MAO A mRNA 的表達(dá)是必須的[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該研究結(jié)果相似，前額葉神經(jīng)細(xì)胞Sp1 和MAO A 累積光密度值的相關(guān)性分析均顯示兩者存在正相關(guān)，提示GC/GR 與MAO A 之間可能通過(guò)Sp1 起交互作用。

綜上所述，GR 功能與前額葉神經(jīng)細(xì)胞MAO A 表達(dá)水平密切相關(guān)，經(jīng)GC 作用后的神經(jīng)細(xì)胞，KLF11、Sp1 和MAO A 表達(dá)水平均明顯升高，其中Sp1 和MAO A 的表達(dá)存在正相關(guān)，提示GC/GR與MAO A 之間可能通過(guò)KLF11、Sp1 起交互作用。這一機(jī)制也有助于解釋如ADHD 等行為障礙患者HPA 軸功能與MAO A 之間的交互作用及機(jī)制，為這些行為異常發(fā)生機(jī)制和防治提供了新的思路。