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        VPS33B對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制研究

        2021-09-17 07:50:38曠思思石麗云廖秀瓊
        吉林醫(yī)學(xué) 2021年9期

        曠思思,石麗云,廖秀瓊

        (深圳市人民醫(yī)院計(jì)劃生育科,廣東 深圳 518028)

        卵巢癌是目前臨床上較為常見(jiàn)的一種女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病早期具有極強(qiáng)的隱匿性,絕大多數(shù)患者一經(jīng)確診便已是中晚期,喪失了手術(shù)根治的時(shí)機(jī),預(yù)后不良[1-2]。故此,探索卵巢的早期診斷新手段以及有效的新療法具有極其重要的意義,亦是提高卵巢癌患者生存周期的重中之重。VPS33B基因英文官方名稱(chēng)為Vacuolar protein sorting 33 homologB(yeast),該基因主要編碼蛋白空泡蛋白分選蛋白33B,上述蛋白是Secl/Munc-18(SM)蛋白家族成員之一[3],既往臨床上關(guān)于VPS33B基因的報(bào)道主要集中在關(guān)節(jié)攣縮以及腎功能不全等方面,尚無(wú)關(guān)于該基因在腫瘤發(fā)病機(jī)制方面的研究報(bào)道。隨著近年來(lái)相關(guān)研究的日益深入,越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)VPS33B基因在肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá),可能是潛在的癌癥相關(guān)基因之一,有望成為卵巢癌治療的潛在靶點(diǎn)[4-5]。鑒于此,本文通過(guò)研究VPS33B對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制,旨在為卵巢癌的診治提供新的思路和靶點(diǎn),現(xiàn)報(bào)告如下。

        1 對(duì)象與方法

        1.1材料:人卵巢癌OVACA-3細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù);RPMI1640培養(yǎng)基以及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;蛋白裂解液RIPA以及蛋白酶抑制劑PMSF均購(gòu)自碧云天公司;PI3K、AKT、c-Myc單克隆抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology;VPS33B多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司;TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;穩(wěn)定過(guò)度表達(dá)的VPS33B慢病毒購(gòu)自銳博公司;特異性針對(duì)VPS33B的RNA干擾片段購(gòu)自廣州銳博公司。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

        1.2研究方法

        1.2.1構(gòu)建過(guò)表達(dá)VPS33B的OVACA-3細(xì)胞株:采用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,于37℃,5%CO2條件下實(shí)施傳代培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)實(shí)施慢病毒轉(zhuǎn)染。取OVACA-3細(xì)胞以D-hanks洗滌3次,加入胰酶消化1~2 min,取適量培養(yǎng)基種植消化,800 r/min離心處理2 min后去除上清液,加入全培吹散細(xì)胞至單細(xì)胞懸液。取5 000個(gè)細(xì)胞置入24孔板內(nèi),加入500μl全培,混勻,8 h后細(xì)胞貼壁后,計(jì)算各試劑所需劑量,進(jìn)行過(guò)度表達(dá)VPS33B的慢病毒轉(zhuǎn)染,6~8 h后換液,持續(xù)培養(yǎng)48 h。

        1.2.2干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組卵巢癌OVACA-3細(xì)胞株轉(zhuǎn)染siRNA靶向干擾VPS33B過(guò)表達(dá)處理:嚴(yán)格遵循siRNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)相關(guān)操作步驟,將干擾片段si-VPS33B離心后用150μl DEPC水溶解配置成終濃度為20 μmol/L的工作液,放置在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取生長(zhǎng)至90%~95%的融合度的OVACA-3細(xì)胞,采用D-hanks洗滌3次,加入胰酶消化2 min,取適量培養(yǎng)基種植消化,800 r/min離心處理2 min后去除上清液,加入全陪吹散細(xì)胞至單細(xì)胞懸液。于6孔板內(nèi)各孔分別接種2×105個(gè)細(xì)胞,接種8~12 h后,待細(xì)胞貼壁,且密度達(dá)至40%~60%匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

        1.2.3細(xì)胞增殖測(cè)定:主要是通過(guò)四甲基偶氮唑(MTT)法進(jìn)行測(cè)定,具體操作如下:首先取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OVACA-3細(xì)胞接種在96孔板內(nèi),于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h,待細(xì)胞貼壁后無(wú)血清培養(yǎng)24 h。分別測(cè)定過(guò)表達(dá)VPS33B、轉(zhuǎn)染siRNA靶向干擾VPS33B過(guò)表達(dá)以及未經(jīng)處理的OVACA-3細(xì)胞,測(cè)定570 nm吸光度值。每次各組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,以平均值作為最終結(jié)果。

        1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè):通過(guò)Annexin V-FITC流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在直徑60 mm的培養(yǎng)皿中,貼壁后在無(wú)血清狀態(tài)下培養(yǎng),一應(yīng)操作嚴(yán)格參照細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)完成,每組重復(fù)3次,以平均值作為最終結(jié)果。

        1.2.5PI3K、AKT、c-Myc蛋白濃度檢測(cè):采用Westernblot法實(shí)現(xiàn),首先在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液,同時(shí)加入2 ml的培養(yǎng)基,將轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞置入EP管內(nèi),并與胰蛋白提取液根據(jù)1∶100比例混合,冷凍10 min,促使細(xì)胞完全裂變?yōu)镋溶液。于EP管內(nèi)以1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 ml,促使細(xì)胞完全裂變?yōu)镕溶液。將E與F溶液按照80∶1的體積混勻,放置在37.5℃保溫相中20 min,冷卻后計(jì)算PI3K、AKT、c-Myc蛋白濃度。

        1.3觀(guān)察指標(biāo):對(duì)比三組OVACA-3細(xì)胞增殖情況,三組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后凋亡情況以及三組OVACA-3細(xì)胞PI3K、AKT、c-Myc蛋白表達(dá)水平。

        2 結(jié)果

        2.1三組OVACA-3細(xì)胞增殖情況評(píng)價(jià):過(guò)表達(dá)VPS33B組OVACA-3細(xì)胞增殖能力低于OVACA-3對(duì)照組和干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組,且干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組OVACA-3細(xì)胞增殖能力高于OVACA-3對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

        表1 三組OVACA-3細(xì)胞增殖情況評(píng)價(jià)

        2.2三組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后凋亡情況評(píng)價(jià):過(guò)表達(dá)VPS33B組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后活細(xì)胞占比低于OVACA-3對(duì)照組和干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組,凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞占比高于OVACA-3對(duì)照組和干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組;且干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后活細(xì)胞占比高于OVACA-3對(duì)照組,凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞占比低于OVACA-3對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

        表2 三組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后凋亡情況評(píng)價(jià)

        2.3三組OVACA-3細(xì)胞PI3K、AKT、c-Myc蛋白表達(dá)水平評(píng)價(jià):過(guò)表達(dá)VPS33B組PI3K、AKT、c-Myc蛋白表達(dá)明顯低于OVACA-3對(duì)照組以及干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組,且干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組PI3K、AKT、c-Myc蛋白表達(dá)均高于OVACA-3對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖1~3。

        圖1 三組細(xì)胞中PI3K蛋白表達(dá)水平變化,依次為干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組、OVACA-3對(duì)照組、過(guò)表達(dá)VPS33B組

        圖2 三組細(xì)胞中AKT蛋白表達(dá)水平變化,依次為干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組、OVACA-3對(duì)照組、過(guò)表達(dá)VPS33B組

        圖3 三組細(xì)胞中c-Myc蛋白表達(dá)水平變化,依次為干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組、OVACA-3對(duì)照組、過(guò)表達(dá)VPS33B組

        3 討論

        迄今為止,關(guān)于卵巢癌的具體病因以及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,可能與環(huán)境、內(nèi)分泌激素、遺傳、晚婚晚育等因素密切相關(guān)[6-8]。由于卵巢癌患者發(fā)病早期往往缺乏特異性癥狀,發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已處于晚期階段,易出現(xiàn)腫瘤灶的轉(zhuǎn)移,臨床治療主要以手術(shù)聯(lián)合化療等綜合療法為主,但效果并不十分理想,嚴(yán)重威脅女性生命健康安全[9-10]。因此,探尋與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因,可為卵巢癌發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ),進(jìn)一步為臨床診治方案的制定提供參考依據(jù)。相關(guān)研究報(bào)道顯示,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,多種基因均會(huì)發(fā)生異常改變,且長(zhǎng)期處于該狀態(tài)下會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)以及分化,從而為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展創(chuàng)造有利條件[11-13]。VPS33B基因主要定位于人15號(hào)染色體q26.1上,其所編碼的蛋白在蛋白排序功能調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[14]。由此可見(jiàn),該基因表達(dá)可能與細(xì)胞增殖、凋亡存在密切相關(guān),其具體作用機(jī)制值得臨床深入研究,可能為卵巢癌的治療提供理論依據(jù)。

        本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),VPS33B對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用,同時(shí)對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。這提示了VPS33B基因可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著抑癌基因的角色??紤]原因可能在于過(guò)表達(dá)VPS33B基因有效阻滯了細(xì)胞周期進(jìn)程,從而促使細(xì)胞周期G1期朝S期轉(zhuǎn)化出現(xiàn)障礙,繼而導(dǎo)致細(xì)胞周期被阻滯在G1期,最終影響細(xì)胞增殖、分化。同時(shí),VPS33B可能與NESG1在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著協(xié)同抑癌的作用,可能是通過(guò)調(diào)控可特異性結(jié)合DNA區(qū)域并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白分子表達(dá),繼而干擾該類(lèi)基因和相互作用的轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體,從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后翻譯。近年來(lái),PI3K/AKT/c-Myc信號(hào)通路是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn),其可在多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá),進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞的增殖以及分化。且有相關(guān)研究報(bào)道[15-17]證實(shí),PI3K/AKT/c-Myc信號(hào)通路的活化可促進(jìn)淋巴血管的形成以及腫瘤細(xì)胞增殖,繼而促使病情朝不可控方向發(fā)展。作為機(jī)體內(nèi)的重要信號(hào)通路,PI3K活性增強(qiáng)可調(diào)控下游抗氧化蛋白,繼而促使機(jī)體受活性氧的損害,發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的氧化以及抗氧化平衡被打破,最終刺激了卵巢癌細(xì)胞的增殖[18-20]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):過(guò)表達(dá)VPS33B組PI3K、AKT、c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于OVACA-3對(duì)照組以及干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組,且干擾VPS33B過(guò)表達(dá)組PI3K、AKT、c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于OVACA-3對(duì)照組。這也提示了VPS33B對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖凋亡的影響機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/c-Myc信號(hào)通路活化有關(guān),值得后續(xù)進(jìn)一步關(guān)注。

        綜上所述,VPS33B可發(fā)揮明顯的抑制卵巢癌細(xì)胞增殖作用,同時(shí)對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用,其可能作用機(jī)制是抑制PI3K/AKT/c-Myc信號(hào)通路活性,值得進(jìn)一步研究。

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