李曉民 梁韋巍 韓 冬 劉愛芹 韓志強(qiáng)

1山東省濰坊市皮膚病防治所，濰坊，261061；2山東省濰坊市安丘市婦幼保健醫(yī)院，濰坊，262100

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是一種好發(fā)于顏面部常見的非黑素性惡性腫瘤[1]，大約5%的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[2]。目前皮膚鱗狀細(xì)胞癌治療仍以手術(shù)、放療為主，對(duì)于不宜手術(shù)、復(fù)發(fā)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者采取化學(xué)治療[3]?；熕幱兄T多嚴(yán)重不良反應(yīng)，開發(fā)新型高效化合物用于皮膚癌治療具有重要意義。

葡萄籽原花青素(grapeseedproanthocyanidin，GSP)具有抗氧化[4]、心血管保護(hù)[5]、抗腫瘤[6]等多種生物活性和藥理作用，用于化妝品中可使皮膚老化減慢[7]。研究發(fā)現(xiàn)Akt/GSK-3β信號(hào)通路與鱗癌細(xì)胞的增殖遷移等生物學(xué)過程有關(guān)[8，9]，然而關(guān)于葡萄籽原花青素是否通過PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路活化抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖的研究甚少。因而，本研究旨在觀察GSP對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖和凋亡的影響，及GSP對(duì)PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hylcone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。葡萄籽原花青素(純度≥90%)、Hoechst33258購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。兔抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK-3β及GSK-3β抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自上?？党缮锕こ逃邢薰尽？雇肐Rdye700及抗鼠IRdye800熒光二抗購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A431細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2條件下的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞融合到90%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的葡萄籽原花青素(5、10、20、40、80 μg/mL)和順鉑(Cis，3 μM)處理24、48、72h。GSP采用滅菌的PBS溶解，加到無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液處理，對(duì)照組加等量的PBS。加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT工作液，放置于37℃的孵箱中恒溫作用4 h，棄去孔中的液體，加DMSO 100 μL，震蕩10 min使結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的細(xì)胞吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.2.3 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液。以1000個(gè)/孔將細(xì)胞接種于6孔板，加GSP(5、10、20、40、80 μg/mL)和Cis 3 μM處理細(xì)胞，每3d更換一次含有藥物的新鮮培養(yǎng)液，9天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色計(jì)數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于24孔板，加不同濃度的GSP和Cis 3 μM處理48 h后，PBS清洗2次，每次5min，收集細(xì)胞，加入0.5 μg/mL的Hoechst 33258染色液染色10 min，PBS清洗2次，碳酸甘油緩沖液封片，于鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的百分比，取平均值。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，收集細(xì)胞加適量細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min，12000 rpm、4℃條件下離心30 min，收集上清液?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，與加樣緩沖液混合后煮沸5 min蛋白變性。每孔加樣60 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，7.5%的脫脂牛奶封閉2 h后，加孵育一抗(p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β及GAPDH抗體，1∶500)，室溫30 min后，置于4℃冰箱過夜，TBST清洗3次，室溫孵育熒光二抗2h(1∶5000)，TBST清洗3次，采用Odyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)掃描條帶。蛋白灰度值采用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以Dunnett’s檢驗(yàn)比較組間均數(shù)的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSP對(duì)A431細(xì)胞活力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加入不同濃度的GSP(0, 5, 10, 20, 40, 80 μg/mL)后，發(fā)現(xiàn)GSP呈濃度和時(shí)間依賴性地降低A431細(xì)胞的活力(P<0.01)，見圖1a；與對(duì)照組相比較，Cis處理24 h、48 h和72 h后細(xì)胞活性顯著下降，見圖1b。進(jìn)一步采用細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)分析，與對(duì)照組相比較，A431細(xì)胞經(jīng)GSP(20, 40, 80 μg/mL)或Cis處理后，細(xì)胞的克隆形成能力受到明顯抑制(P<0.05)，見圖2a、2b。

圖1 細(xì)胞活性測(cè)定 1a:GSP對(duì)細(xì)胞活性的影響；1b:Cis對(duì)細(xì)胞活性的影響。與對(duì)照組相比較，**P<0.01 圖2 GSP對(duì)A431細(xì)胞克隆形成的影響 2a:細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)典型圖片, A431經(jīng)GSP 40 μg/mL處理；2b:GSP和Cis對(duì)A431細(xì)胞克隆數(shù)目的影響。與對(duì)照組相比較，*P<0.05,**P<0.01

2.2 GSP誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡 Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，A431細(xì)胞經(jīng)GSP(10, 20, 40, 80 μg/mL)或Cis處理后，與對(duì)照組相比較，凋亡細(xì)胞的百分比顯著增加(P<0.05)，見圖3a、3b。

3a：Hoechst 33258染色A431細(xì)胞凋亡情況，3b：GSP和Cis對(duì)A431細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比的影響。與對(duì)照組相比較，**P<0.01；bar=100 μm

2.3 GSP調(diào)節(jié)A431細(xì)胞PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)傳導(dǎo) 結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)GSP濃度為40 μg/mL時(shí)細(xì)胞活性抑制率為47.48%，接近半數(shù)抑制濃度，而且凋亡增加，組間比較差異顯著(P<0.05)，因而使用GSP作用48 h后，Western blot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，當(dāng)濃度為40 μg/mL GSP處理后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的p-PI3K、p-Akt和p-GSK-3β表達(dá)水平明顯降低，提示GSP能夠有效抑制PI3K/Akt和GSK-3β蛋白磷酸化，能夠抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路(圖4a、4b)。

4a: Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)典型圖片, A431經(jīng)GSP 40 μg/mL處理；4b: GSP對(duì)p-PI3K/p-Akt/ p-GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比較，*P<0.05,**P<0.01

3 討論

GSP是來(lái)源于葡萄等多種植物的一類黃酮多酚類物質(zhì)[10]，已發(fā)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌等多種腫瘤具有較好的藥理作用，但對(duì)于皮膚鱗狀細(xì)胞癌是否具有潛在治療價(jià)值，以及具體的機(jī)制研究并不深入。本實(shí)驗(yàn)以人皮膚鱗狀細(xì)胞癌為研究對(duì)象，觀察GSP對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A431細(xì)胞增殖和凋亡的影響，初步了解GSP對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌作用的下游信號(hào)通路，為其用于皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新線索。

本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)GSP顯著抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的增殖，隨著劑量和時(shí)間呈依賴性抑制細(xì)胞活力。這些結(jié)果表明GSP對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌具有很好的藥理活性。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示GSP(10, 20, 40, 80 μg/mL)顯著增加A431細(xì)胞凋亡，提示GSP通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。研究表明，原花青素誘導(dǎo)結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞等癌癥細(xì)胞的凋亡[11，12]，可能是一種非常有價(jià)值的潛在癌癥治療藥物。

Akt/GSK-3β信號(hào)通路在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，包括皮膚癌[13]。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路異?；罨c腫瘤增殖、遷移、細(xì)胞凋亡等腫瘤行為密切相關(guān)[14]。PI3K是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要激酶，PI3K活化使Akt在Ser473位點(diǎn)磷酸化被激活，進(jìn)一步磷酸化下游的GSK-3β[15]。在結(jié)腸癌和骨肉瘤細(xì)胞，原花青素通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16，17]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，原花青素通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)體內(nèi)的細(xì)胞損傷和組織修復(fù)過程[18，19]。PI3K/Akt通路可能是原花青素發(fā)揮作用的重要途徑之一。在原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞，原花青素能夠調(diào)節(jié)GSK-3β保護(hù)缺氧再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)原花青素可以顯著抑制A431細(xì)胞中PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能是抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原因之一，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GSP能夠抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能與抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。