王巧宇，劉瑩，申金田，王開元，梅榮，湯建，張林松，聞崇煒

(1. 江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212050； 3. 亳州學(xué)院中藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶BombyxmoriLinnaeus的幼蟲感染白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant而致死的干燥體，圓柱形，多彎曲皺縮；氣微腥，味微咸，性平，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)之功效[1]。研究發(fā)現(xiàn)僵蠶多種化學(xué)成分(包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、甾體、黃酮、有機(jī)酸等)具有抗驚厥、抗凝、抗菌、抗癌、降糖、降脂、神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)等作用[2]。研究表明[3-4]，僵蠶粉末抗驚厥效果優(yōu)于僵蠶煎液，能夠顯著降低小鼠驚厥率，僵蠶提取物對(duì)最大電休克驚厥模型有對(duì)抗作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論而發(fā)展出的新的研究手段，它通過高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、軟件處理，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)，將藥物與機(jī)體的作用整體系統(tǒng)地表現(xiàn)出來。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究可以提供可量化數(shù)據(jù)，科學(xué)解讀中藥治療疾病的作用機(jī)制[5-6]。目前，僵蠶的息風(fēng)止痙作用機(jī)制尚不明確。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索僵蠶主要物質(zhì)基礎(chǔ)與靶點(diǎn)、疾病的相互作用關(guān)系，以系統(tǒng)、全面地闡述僵蠶息風(fēng)止痙的藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

PubChem數(shù)據(jù)庫 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)、David生物信息注釋系統(tǒng) (https://david.ncifcrf.gov/)、KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)、STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)、Swiss Target Prediction、ChemDraw14.0、Cystoscape 3.5.1、Open Babel 2.4.1。

1.2 僵蠶化學(xué)成分的收集與整理

通過文獻(xiàn)檢索僵蠶的化學(xué)成分，剔除氨基酸及核苷等成分，利用 PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)成分的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)，并采用ChemDraw 軟件繪制PubChem 數(shù)據(jù)庫中未收載的成分，所有化學(xué)結(jié)構(gòu)文件均采用 Open Babel 2. 4. 1 軟件轉(zhuǎn)換為Smiles格式保存。

1.3 僵蠶化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選

將僵蠶化學(xué)成分的Smiles格式上傳至Swiss Target Prediction分析軟件，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”進(jìn)行靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選，并提取靶蛋白、靶基因名稱。

1.4 僵蠶抗驚厥潛在作用靶點(diǎn)及注釋

將驚厥(convulsions)作為關(guān)鍵詞輸入DisGeNET數(shù)據(jù)庫，檢索相關(guān)的人類基因，再將獲得的靶點(diǎn)信息與僵蠶活性成分潛在靶點(diǎn)相比對(duì)，最后得到僵蠶息風(fēng)止痙作用的靶點(diǎn)及蛋白信息。

1.5 僵蠶抗驚厥“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模式，繪制僵蠶成分與其治療驚厥靶點(diǎn)的作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 僵蠶抗驚厥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建僵蠶靶蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”、最低相互作用閾值設(shè)為“medium confidence”，其余參數(shù)均保持默認(rèn)操作。用Cytoscape軟件中的“Network Analyzer”插件，分析PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩?，?jì)算“節(jié)點(diǎn)度值分布”和“介數(shù)中心性”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，進(jìn)而獲得僵蠶治療驚厥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.7 基因功能分析與通路富集分析

利用Cytoscape軟件中的“BiNGO”插件從生物過程、分子功能以及細(xì)胞組成3個(gè)方面對(duì)僵蠶治療驚厥的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 富集分析。另外，利用David平臺(tái)對(duì)僵蠶治療驚厥的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.8 分子對(duì)接模擬

將篩選出的主要活性成分通過PubChem下載其SDF格式，將篩選的主要蛋白靶點(diǎn)通過 PDB 數(shù)據(jù)庫選擇其最佳蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并下載其PDB格式文件。將下載好的蛋白質(zhì)及活性成分導(dǎo)入PyMol進(jìn)行拆分、格式轉(zhuǎn)化等預(yù)處理。蛋白靶點(diǎn)及化學(xué)成分導(dǎo)入 AutoDock軟件，進(jìn)行除水、加氫，計(jì)算電荷，運(yùn)行軟件對(duì)活性成分和靶點(diǎn)蛋白分別進(jìn)行對(duì)接。在輸出結(jié)果中，結(jié)合能越低，表明活性成分與靶蛋白之間的結(jié)合力越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 僵蠶的化學(xué)成分

文獻(xiàn)檢索獲得僵蠶18個(gè)化學(xué)活性成分，其中多肽類2個(gè)、甾體類9個(gè)、黃酮類5個(gè)、有機(jī)酸類2個(gè)。

2.2 僵蠶化學(xué)成分抗驚厥潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選

基于Swiss Target Prediction平臺(tái)預(yù)測(cè)上述化學(xué)成分的潛在作用靶點(diǎn)，除quercetin-4′-O-methyl-7-O-b-D-glucopyranoside未找到作用靶點(diǎn)外，其他17個(gè)成分共獲得作用靶點(diǎn)1 311個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后獲取有效作用靶點(diǎn)513個(gè)。以Convulsions為關(guān)鍵詞，基于DisGeNET數(shù)據(jù)庫，檢索得到相關(guān)基因117個(gè)，將僵蠶活性成分靶點(diǎn)與驚厥致病基因進(jìn)行比對(duì)，得到僵蠶抗驚厥作用靶點(diǎn)共22個(gè)，提取靶點(diǎn)相關(guān)信息。包括丁酰膽堿酯酶(Butyrylcholinesterase)、多巴胺D4受體(Dopamine D4 receptor)以及環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase-2)等22個(gè)靶點(diǎn)均與僵蠶抗驚厥有直接或間接作用。

2.3 僵蠶活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以Cytoscape軟件對(duì)僵蠶活性成分與作用靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行圖形化展示并構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。18個(gè)活性成分中有16個(gè)與僵蠶抗驚厥靶點(diǎn)有直接作用(圖1)。由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可知化合物的中位度數(shù)為5，篩選出度值≥5的化合物有3β,5α-二羥基-(22E,24R)-麥角甾醇-7,22-dien-6-酮；(22E,24S)-5,8-環(huán)氧-24-甲基膽甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇；22E-7α-甲氧基-5α,6α-環(huán)氧麥角甾醇8(14),22-dien-3β-醇；環(huán)(L-脯-L-纈)；山奈酚；環(huán)(丙脯)二肽；槲皮素；豆甾烷-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇；5,6-環(huán)氧-(22E,24R)-麥角甾醇-8(14)22-二烯-3,7-二醇；度值分別為10、9、7、6、6、5、5、5、5，這9個(gè)化合物可能是僵蠶息風(fēng)止痙的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 僵蠶“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 僵蠶抗驚厥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)有20個(gè)節(jié)點(diǎn)、58條相互作用連線(圖2)，線條的粗細(xì)代表了相互作用力的強(qiáng)弱，度值平均為5.8，介數(shù)平均為5.029 2×10-2。靶點(diǎn)度值和介數(shù)均超過平均值的靶點(diǎn)共有6個(gè)(表1)，包括Interleukin-6、Mu opioid receptor等。

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)

圖2 僵蠶抗驚厥作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 基因功能分析與通路富集分析

GO富集分析結(jié)果如圖3所示，22個(gè)靶點(diǎn)主要在細(xì)胞膜上通過調(diào)節(jié)細(xì)胞過程、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性和受體活性，對(duì)刺激應(yīng)答等生物過程發(fā)揮作用。

圖3 僵蠶抗驚厥靶點(diǎn)GO富集分析

KEGG通路富集共篩選出有關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)代謝等9條信號(hào)通路(圖4)。

圖4 僵蠶主要靶點(diǎn) KEGG 富集通路氣泡圖

2.6 分子對(duì)接模擬

分子對(duì)接結(jié)果經(jīng)過熱圖分析得到圖5(對(duì)接結(jié)果只保留每對(duì)分子對(duì)接的結(jié)合能絕對(duì)值最高的)，對(duì)接打分的絕對(duì)值≥7的活性成分有5個(gè)(9.26%)，絕對(duì)值在7到3.5之間的有47個(gè)(87.03%)，絕對(duì)值<3.5的有2個(gè)(3.70%)。僵蠶中活性成分與驚厥潛在靶點(diǎn)分子的結(jié)合圖見圖6。

compound 1: 3β,5α-二羥基-(22E,24R)-麥角甾醇-7,22-dien-6-酮；compound 2: (22E,24S)-5,8-環(huán)氧-24-甲基膽甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇；compound 3: 22E-7α-甲氧基-5α,6α-環(huán)氧麥角甾醇8(14),22-dien-3β-醇；compound 4: 環(huán)(L-脯-L-纈)；compound 5: 山奈酚；compound 6: 環(huán)(丙脯)二肽；compound 7: 槲皮素；compound 8: 豆甾烷-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇；compound 9: 5,6-環(huán)氧-(22E,24R)-麥角甾醇-8(14)22-二烯-3,7-二醇。無原配體的蛋白靶點(diǎn)以-4 kcal/mol為打分值，用“×”標(biāo)注

3 討論

驚厥是兒科常見急癥，也是最常見的小兒神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以臨床出現(xiàn)肢體節(jié)律性抽搐、昏迷為主要特征。引起驚厥發(fā)作的病因有很多，主要以熱性驚厥、顱內(nèi)感染和癲癇為主[7]。驚厥的頻繁發(fā)作或持續(xù)狀態(tài)可危及患兒生命或使患兒腦部損傷，影響小兒的智力發(fā)育和健康。研究表明[8]，腦細(xì)胞生理代謝發(fā)生變化可使鈣離子泵功能失調(diào)，鈉、鈣離子增多，使腦細(xì)胞腫脹、結(jié)構(gòu)損害甚至死亡。臨床上抗驚厥的藥物有很多，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以分析其可能的作用機(jī)制。

在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中得到靶點(diǎn)度值和介數(shù)均超過平均值的靶點(diǎn)有IL-6、PTGS2、CNR1、DRD2、ACHE和OPRM1。IL-6基因在胚胎發(fā)育過程中，作為信號(hào)分子從肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中分泌，影響肝小葉的生長與功能。ACHE在類紅細(xì)胞和神經(jīng)元突觸中表達(dá)。在脊椎動(dòng)物中，乙酰膽堿是神經(jīng)元之間信息傳遞的關(guān)鍵物質(zhì)[9]，可將信號(hào)從神經(jīng)系統(tǒng)傳遞到肌肉纖維的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，刺激肌肉使肌肉僵直。已有研究表明，乙酰膽堿受體與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如癲癇、精神分裂癥、老年癡呆癥等[10]，提示IL-6與ACHE在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面發(fā)揮重要作用，這也說明僵蠶治療癲癇、驚厥等病癥具有一定的功效。

A：PTGS2和compound 3；B：OPRM1和compound 6；C：IL-6和compound 6；D：DRD2和compound 6；E：CNR1和compound 2；F：ACHE和compound 3

GO富集與KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，僵蠶抗驚厥作用靶點(diǎn)主要分布在細(xì)胞膜上，具有受體活性、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性、蛋白質(zhì)結(jié)合及對(duì)刺激應(yīng)答等功能，并通過神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)代謝等9條信號(hào)通路發(fā)揮作用，預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)和通路大多與神經(jīng)保護(hù)密切相關(guān)，靶點(diǎn)與通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗驚厥作用，提示這可能是治療驚厥的關(guān)鍵。驚厥的發(fā)病部位主要是神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路與高熱驚厥和夜間額葉癲病相關(guān)，抗內(nèi)源性大麻素信號(hào)通路與嬰兒早期癲癇性腦病相關(guān)，膽堿能突觸通路與良性家族性新生兒驚厥和夜間額葉癲癇疾病相關(guān)，可以推測(cè)這些是僵蠶抗驚厥作用的關(guān)鍵通路[9-10]。已有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，尼古丁成癮性通路可參與神經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫及代謝過程，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)都存在廣泛的影響。此外有研究證實(shí)缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路與神經(jīng)干細(xì)胞的功能密切相關(guān)[12]，HIF-1通過調(diào)控其靶點(diǎn)的表達(dá)來適應(yīng)不同的氧氣水平，精確的氧氣濃度控制也為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的切入點(diǎn)[13]。賀銳等[14]研究表明，鈣信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)Ca2+介導(dǎo)的突觸后膜去極化，使內(nèi)源性大麻素與突觸前膜大麻素1型(CB1)受體結(jié)合，從而對(duì)抗神經(jīng)元過度興奮。脂肪水解酶1(FAAH1)是一種內(nèi)源性大麻素水解酶，其可在神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟中表達(dá)，研究表明[15]，F(xiàn)AAH1抑制劑能夠抵抗海人酸誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元興奮毒性，顯著減少大鼠的癲癇行為。可見FAAH1的適當(dāng)抑制和抗內(nèi)源性大麻素信號(hào)通路協(xié)調(diào)作用可以有效抑制癲癇疾病的發(fā)作。僵蠶息風(fēng)止痙歸肝經(jīng)的理論與本研究結(jié)果不謀而合，證實(shí)了預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)分析平臺(tái)，系統(tǒng)地研究了僵蠶抗驚厥作用機(jī)制，構(gòu)建了僵蠶“活性成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，為臨床治療驚厥提供了參考。