李小蘭， 王韶軍， 馬躍飛， 王琳琳

(1. 張家口市中醫(yī)研究所附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 張家口 075000 ； 2. 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 張家口 075000)

順鉑是目前治療腫瘤的常用化療藥物，但由于其具有明顯的腎毒性，導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用中受限[1]。Toll樣受體4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)通路是與機(jī)體組織細(xì)胞炎癥損傷相關(guān)的重要信號(hào)通路[2]。研究證實(shí)，TLR4異常激活能夠促進(jìn)體內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)而激活NF-κB通路及促進(jìn)相關(guān)蛋白表達(dá)，而NF-κB通路激活后在炎癥因子的作用下又進(jìn)一步加重體內(nèi)炎性反應(yīng)[3]。研究表明，腎損傷的發(fā)病機(jī)制及疾病轉(zhuǎn)歸與TLR4/NF-κB通路及相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)[4]。調(diào)氣湯是以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)自擬的一種中藥方劑，其內(nèi)部成分有降壓、降肌酐等作用，但關(guān)于其對(duì)腎臟炎癥，尤其是對(duì)化療藥物誘發(fā)的腎毒性的作用尚不清楚。因此，本研究擬通過構(gòu)建順鉑誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷動(dòng)物模型，探討調(diào)氣湯對(duì)腎功能的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器

清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，8周齡，體重180～200 g，購于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)張家口市中醫(yī)研究所附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào)20180012)。

自擬調(diào)氣湯(由黨參20 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，陳皮10 g，清半夏10 g，萊菔子15 g，紫蘇葉12 g，砂仁10 g，雞內(nèi)金15 g，佩蘭15 g，黃連12 g，丹參15 g，川芎15 g，白茅根30 g，酒大黃10 g，土茯苓30 g，川牛膝15 g組成)，由藥材飲片制成每毫升含5 g生藥的制劑(張家口市張?jiān)嬈瑥S)；順鉑注射液(杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；氨磷汀(美羅藥業(yè)股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛含量檢測(cè)試劑盒，TNF-α、IL-6及IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒，RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，兔抗大鼠TLR4、兔抗大鼠NF-κB p65、兔抗大鼠GAPDH抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 均為碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品；HE染液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

CX23顯微鏡(日本Olympus公司)；Microfuge 20離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；MB-580多功能酶標(biāo)儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)；ChemiDoc XRS型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；AU5800全自動(dòng)生化分析儀(美國Beckman Coulter公司)；石蠟切片機(jī)(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；DYCZ-30C雙垂直電泳槽(北京海天友誠科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腎損傷大鼠模型建立及分組處理 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組，模型組，調(diào)氣湯低、中、高劑量組及陽性對(duì)照組，每組15只。除正常對(duì)照組外，參照文獻(xiàn)[5]，于動(dòng)物尾靜脈注射順鉑(2.5 mg/kg)，1次/d，連續(xù)5 d，建立腎損傷大鼠模型。大鼠血清尿素氮、肌酐含量較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)及腎組織病理學(xué)改變視為造模成功。根據(jù)臨床給藥劑量按照體表面積換算，分別按照2、4、8 mL/kg劑量予以調(diào)氣湯低、中、高劑量組大鼠調(diào)氣湯灌胃，陽性對(duì)照組予以腹腔注射氨磷汀(1 mg/kg)[6]，正常對(duì)照組及模型組給予生理鹽水(2 mL/kg)灌胃，1次/d，連續(xù)給藥60 d。

1.2.2 標(biāo)本采集及處理 各組給藥結(jié)束后24 h，予以1%戊巴比妥鈉腹腔注射(50 mg/kg)麻醉大鼠。每組各取6只大鼠，于腹主動(dòng)脈取血5 mL，以4 ℃，3 500 r/min離心10 min，取上層血清用于檢測(cè)肌酐、尿素氮；取脾臟和腎臟組織，分別置于玻璃勻漿器中，加入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水，充分勻漿后，3 500 r/min離心10 min，取上清液用于檢測(cè)炎癥因子、SOD和丙二醛含量；另外每組各取6只大鼠腎臟，在玻璃勻漿器中加入RIPA蛋白裂解液進(jìn)行勻漿，以4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液行蛋白免疫印跡檢測(cè)；其余每組3只大鼠取腎臟組織作切片行HE染色。

1.2.3 比色法檢測(cè)血清相關(guān)指標(biāo) 取“1.2.2”血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清尿素氮和肌酐含量。按照試劑盒說明書分別用比色法和顯色法檢測(cè)腎組織SOD活性和丙二醛含量。

1.2.4 ELISA檢測(cè)腎組織和脾臟炎癥因子含量 取“1.2.2”大鼠腎臟和脾臟上清液。96孔板設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清液100 μL，空白孔不加樣；室溫反應(yīng)2 h；棄液、洗孔，每孔加生物素化抗體100 μL，室溫反應(yīng)1 h；棄液、洗孔，每孔加HRP標(biāo)記的親和素100 μL，室溫反應(yīng)1 h；棄液、洗孔，每孔加入TMB溶液100 μL，室溫避光顯色30 min左右，至肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品孔呈現(xiàn)明顯的梯度藍(lán)色；每孔依次加入終止液50 μL，見藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色；用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(D)值；計(jì)算樣品濃度。

1.2.5 腎組織HE染色 取腎組織，10%中性甲醛中固定24 h，乙醇脫水、二甲苯透明各5min，浸蠟、包埋、5 μm切片，經(jīng)過二甲苯、乙醇脫蠟至水，隨后蘇木素染3 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗；伊紅染色2 min；梯度乙醇和二甲苯脫水透明，切片晾干，中性樹膠封片；于顯微鏡下觀察腎組織病理改變。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測(cè)腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平 取“1.2.2”采集腎組織上清液，100 ℃水浴5 min變性；BCA法測(cè)定蛋白濃度；取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。濃縮膠用恒壓80 V進(jìn)行電泳，當(dāng)電泳至分離膠后改為120 V繼續(xù)進(jìn)行電泳；350 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h；PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入兔抗大鼠TLR4(1 ∶300)、NF-κB(1 ∶200)及GAPDH抗體(1 ∶500)4 ℃孵育過夜；PBST洗膜3次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h；PBST再次清洗3次；進(jìn)行發(fā)光、顯影，拍照，凝膠圖像系統(tǒng)處理；用Image J 1.52v軟件進(jìn)行灰度值檢測(cè)及分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 調(diào)氣湯對(duì)大鼠血清尿素氮和肌酐含量以及腎組織病理的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清尿素氮和肌酐均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，調(diào)氣湯各劑量組及陽性對(duì)照組血清尿素氮和肌酐顯著降低(P<0.05)，且隨著調(diào)氣湯劑量增加，血清尿素氮和肌酐含量逐漸降低。見表1。HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)正常，組織細(xì)胞排列整齊，未見明顯病理學(xué)改變；模型組腎組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，腎小球萎縮，腎小管上皮細(xì)胞脫落，腎間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織細(xì)胞壞死、脫落，腎間質(zhì)表現(xiàn)出纖維化病理性改變；與模型組相比，調(diào)氣湯各劑量組及陽性對(duì)照組大鼠腎組織病理變化明顯改善，腎小球萎縮和腎小管上皮細(xì)胞脫落減少，腎間質(zhì)纖維化明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見圖1。上述結(jié)果提示腎損傷大鼠模型造模成功，且調(diào)氣湯可改善腎功能和減輕腎組織損傷。

表1 各組大鼠血清尿素氮、肌酐含量比較

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×200)

2.2 調(diào)氣湯對(duì)大鼠腎組織炎癥因子和氧化應(yīng)激水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β及丙二醛含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，調(diào)氣湯各劑量組及陽性對(duì)照組TNF-α、IL-6、IL-1β及丙二醛含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高 (P<0.05)，且隨著調(diào)氣湯劑量的增加，TNF-α、IL-6、IL-1β及丙二醛含量逐漸降低，SOD活性逐漸升高。見表2。

表2 各組大鼠腎組織炎癥因子和氧化應(yīng)激標(biāo)志物含量比較

2.3 調(diào)氣湯對(duì)大鼠脾臟細(xì)胞因子水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟TNF-α、IL-17及MMP-9含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，調(diào)氣湯各劑量組及陽性對(duì)照組大鼠TNF-α、IL-17及MMP-9含量顯著降低(P<0.05)，隨著調(diào)氣湯劑量增加，TNF-α、IL-17及MMP-9水平逐漸降低。見表3。

表3 各組大鼠脾臟細(xì)胞因子含量比較

2.4 調(diào)氣湯對(duì)大鼠腎組織TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高(P均<0.05)；與模型組比較，調(diào)氣湯各劑量組及陽性對(duì)照組TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且隨著調(diào)氣湯劑量增加，腎組織TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平逐漸降低。見圖2。

① 正常對(duì)照組；② 模型組；③ 調(diào)氣湯低劑量組；④ 調(diào)氣湯中劑量組；⑤ 調(diào)氣湯高劑量組；⑥ 陽性對(duì)照組。a：P<0.05，與正常對(duì)照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與調(diào)氣湯低劑量組比較；d：P<0.05，與調(diào)氣湯中劑量組比較

3 討論

順鉑是目前臨床常見的一種引起腎損害的藥物[7]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化中最豐富的活性醛，是細(xì)胞損傷的重要信號(hào)分子，作為細(xì)胞和組織氧化應(yīng)激的指標(biāo)[8]，而SOD是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，能夠防止機(jī)體組織細(xì)胞過度氧化損傷，其水平的降低提示機(jī)體自我修復(fù)能力下降。TNF-α、IL-6、IL-1β是體內(nèi)敏感的炎癥信號(hào)分子，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)不同程度的炎癥反應(yīng)時(shí)，其水平則會(huì)顯著升高[9]。本研究中各劑量調(diào)氣湯組腎組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、丙二醛水平較模型組降低，SOD升高，并且呈劑量依賴性，提示調(diào)氣湯對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎臟炎癥和氧化應(yīng)激有改善作用。

此外，順鉑的毒性作用可造成腎臟明顯損傷，出現(xiàn)尿量減少，血肌酐、尿素氮水平增高。腎組織鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞增加，甚至纖維化。本研究給予腎損傷大鼠調(diào)氣湯干預(yù)后，隨著給藥劑量增加，腎功能有所恢復(fù)，肌酐、尿素氮水平降低，且腎臟病理中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腎小球纖維化較模型組動(dòng)物明顯減輕，證實(shí)調(diào)氣湯對(duì)腎臟有保護(hù)作用，可明顯改善腎功能，緩解纖維化。

TLR4是TLR蛋白家族的主要成員之一[10]，與機(jī)體組織炎癥密切相關(guān)[11]，其異常激活是誘導(dǎo)腎臟損傷的重要因素[12]。NF-κB是與炎癥因子信號(hào)傳遞相關(guān)的信號(hào)通路，該通路及上下游相關(guān)蛋白的激活能夠促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)加重[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠急性腎損傷的發(fā)生與TLR4/NF-κB通路的異常激活密切相關(guān)，抑制TLR4/NF-κB通路能夠改善大鼠腎功能，緩解腎組織損傷[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予不同劑量調(diào)氣湯后，腎損傷大鼠腎組織TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示調(diào)氣湯在一定劑量范圍內(nèi)能夠呈劑量依賴性抑制TLR4/NF-κB通路的過度激活，從而發(fā)揮其腎組織保護(hù)作用。

綜上所述，自擬調(diào)氣湯能夠降低順鉑誘導(dǎo)的腎損傷大鼠腎組織炎癥因子含量，緩解腎組織氧化應(yīng)激損傷，改善腎功能及腎組織病理變化，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。