朱 奇，鄭丹桂，陳玉翡，陸斌興

合山市疾病預(yù)防控制中心，廣西來(lái)賓 546500

單核細(xì)胞增生李斯特菌簡(jiǎn)稱為單增李斯特菌，為革蘭陽(yáng)性短小桿菌或球桿菌，需氧或微需氧，最適宜的生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃，4 ℃時(shí)仍可生長(zhǎng)(冷增菌可提高檢出率)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，普通培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，但在含血液、血清、腹水等成分的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更好。單增李斯特菌在自然界中廣泛存在，是一種食源性致病菌，并能夠引起人畜共患病[1-3]。單增李斯特菌污染了食品，對(duì)人類的健康產(chǎn)生很大的威脅，易引起成人敗血癥和新生兒腦膜炎等疾病。在美國(guó)和歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)發(fā)病率為2/100 000～8/100 000，病死率為20%～30%，或更高，被世界衛(wèi)生組織列為關(guān)系食品安全的重要病原菌之一[4]。因此，在食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。在乳制品、蔬菜、水果、海產(chǎn)品及肉類等食品中檢出率較高，尤其在冷藏食品中檢出率更高，在食物保鮮過(guò)程中有很大的安全隱患。

能力驗(yàn)證是通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)比對(duì)，以達(dá)到評(píng)估實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力和校準(zhǔn)能力，是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力評(píng)價(jià)的重要手段，深受國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室管理者的重視[5-6]。參加實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證，不僅可以加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室之間的技術(shù)交流，還能使彼此的檢測(cè)水平有所提高。實(shí)驗(yàn)室通過(guò)能力驗(yàn)證，可以對(duì)采用的檢測(cè)方法和使用的儀器進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)過(guò)程中存在的問(wèn)題，并及時(shí)進(jìn)行整改，以達(dá)到不斷提高檢測(cè)人員的檢驗(yàn)水平的目的。為提高檢驗(yàn)人員對(duì)該菌的檢測(cè)能力，本中心微生物實(shí)驗(yàn)室參加了廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心組織的“食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌”檢測(cè)能力驗(yàn)證考核。同時(shí)使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)分離生化鑒定方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩種方法結(jié)果進(jìn)行比較分析，達(dá)到為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)單增李斯特菌提供一種快速、準(zhǔn)確的方法的目的。

1 材料與方法

1.1樣品來(lái)源和性狀 單增李斯特菌樣品由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供，編號(hào)為18-C800和18-J754，裝在真空西林瓶中，呈凍干塊狀。

1.2檢驗(yàn)方法 依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)：GB 4789.30-2016[7]中相關(guān)要求進(jìn)行增菌、分離、鑒定和RT-PCR。

1.3檢測(cè)項(xiàng)目 單增李斯特菌的定性檢測(cè)。

1.4儀器與試劑 李氏菌增菌肉湯LB1、李氏菌增菌肉湯LB2、單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基、PALCAM瓊脂平板、TSA-YE培養(yǎng)基、單增李斯特菌生化鑒定試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑等均在產(chǎn)品有效期內(nèi)使用。除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，所需其他設(shè)備如下：恒溫培養(yǎng)箱：(30±1)℃及(36±1)℃、冰箱2～5 ℃、RT-PCR擴(kuò)增儀。

1.5實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.5.1培養(yǎng)分離及生化檢測(cè) (1)取稀釋好的樣品液1 mL加入李氏菌增菌肉湯LB1中，(30±1)℃ 24 h培養(yǎng)后再取0.1 mL 加入李氏菌增菌肉湯LB2中(30±1)℃ 24 h培養(yǎng)。(2)取李氏菌增菌肉湯LB2于單增李斯特菌顯色平板及PALCAM平板上分區(qū)劃線于(36±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。再挑取PALCAM瓊脂平板和單增李斯特菌顯色平板上典型或可疑菌落5個(gè)以上轉(zhuǎn)接到TSA-YE培養(yǎng)基行純化培養(yǎng)，于30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.5.2生化試驗(yàn) 取TSA-YE培養(yǎng)基上典型菌落，按相關(guān)說(shuō)明進(jìn)行生化檢測(cè)等。

1.5.3RT-PCR 取稀釋好的樣品原液，按試劑盒說(shuō)明書操作，進(jìn)行RT-PCR。

2 結(jié) 果

18-C800為陽(yáng)性，18-J754為陰性。上報(bào)結(jié)果反饋，本實(shí)驗(yàn)室所鑒定的兩份樣品結(jié)果評(píng)價(jià)獲得滿意。編號(hào)18-C800和編號(hào)18-J754單增李斯特菌菌落特征、生化鑒定情況具體見(jiàn)表1、2；RT-PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 菌落特征

表2 生化檢測(cè)結(jié)果

表3 RT-PCR鑒定結(jié)果

3 討 論

隨著經(jīng)濟(jì)的全球化，食品安全已經(jīng)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，而微生物污染已成為食品安全的首要問(wèn)題。食源性致病菌是引發(fā)食物中毒和食源性疾病暴發(fā)的重要因素。傳統(tǒng)檢測(cè)方法根據(jù)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的檢驗(yàn)流程進(jìn)行操作，原理是依據(jù)不同病原體的化學(xué)組成或產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，通過(guò)一系列生化反應(yīng)，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。通常包括微生物形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)和培養(yǎng)特性評(píng)價(jià)兩方面。傳統(tǒng)的常規(guī)培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)為無(wú)特殊設(shè)備要求，方法經(jīng)典可靠。但是，該類檢測(cè)方法需要進(jìn)行增菌、分離等操作，耗時(shí)費(fèi)力，完成整個(gè)檢測(cè)流程周期較長(zhǎng)，通常需要1周左右。近年來(lái)，隨著PCR檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，其在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，RT-PCR作為PCR檢測(cè)方法中的一種，因其具有較高的特異度和靈敏度，并且還有檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，在食品微生物檢測(cè)的應(yīng)用中有較大優(yōu)勢(shì)。

常規(guī)分離鑒定方法雖然有較高準(zhǔn)確度，但對(duì)檢測(cè)人員操作能力和培養(yǎng)基質(zhì)量等也有較高要求。在微生物檢驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注培養(yǎng)基的質(zhì)量，嚴(yán)格按照廠家提供的使用說(shuō)明書進(jìn)行保存、配制和使用。單增李斯特顯色平板的優(yōu)點(diǎn)是有較強(qiáng)選擇特異性，缺點(diǎn)是對(duì)雜菌進(jìn)行抑制的同時(shí)，也會(huì)干擾目標(biāo)菌的生長(zhǎng)，使其生長(zhǎng)緩慢或抑制生長(zhǎng)。PALCAM瓊脂平板培養(yǎng)24 h的菌落太小，要48 h才可以觀察到滿意的結(jié)果，時(shí)間較久，但是PALCAM瓊脂平板可以擴(kuò)大目標(biāo)菌的檢測(cè)范圍。而單增李斯特菌顯色平板24 h就可觀察到藍(lán)綠色菌落。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中這兩種平板配合使用最好。顯色培養(yǎng)基是一種新型分離培養(yǎng)基，其反應(yīng)的靈敏度和特異度有了很大提升，與傳統(tǒng)培養(yǎng)基相比，使菌落特征判斷更加容易，提高了菌落分離的速度。在單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基上，可將可疑菌落進(jìn)行多次反復(fù)分離純化，以提高后續(xù)鑒定的準(zhǔn)確率[8]。

常規(guī)培養(yǎng)法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，優(yōu)點(diǎn)是普通實(shí)驗(yàn)室都能開展檢測(cè)，成本較低；缺點(diǎn)是純化、分離、鑒定步驟多，檢測(cè)時(shí)間周期長(zhǎng)，溶血試驗(yàn)操作難度較大，導(dǎo)致檢測(cè)人員在經(jīng)驗(yàn)不足的情況下，易產(chǎn)生漏檢和假陽(yáng)性。本研究通過(guò)RT-PCR對(duì)增菌液進(jìn)行篩選檢測(cè)的過(guò)程，省去了分離、鑒定過(guò)程中所用的時(shí)間，但是可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果[5]，因此，在日常食品單增李斯特菌檢測(cè)工作中，可以將RT-PCR方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，先通過(guò)RT-PCR方法對(duì)樣品的增菌液進(jìn)行快速篩選，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的樣品，再按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行目標(biāo)菌的分離培養(yǎng)和生化鑒定，這樣可以實(shí)現(xiàn)提高目標(biāo)菌檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。為指導(dǎo)臨床用藥治療和政府行政部門依法決策提供技術(shù)支撐。

通過(guò)參加實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)質(zhì)量得到進(jìn)一步驗(yàn)證，取得了滿意的結(jié)果，提高了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，確保了檢測(cè)結(jié)果的可靠性[9-10]。相信隨著科技的發(fā)展，會(huì)有更多快速、靈敏、特異的方法得到廣泛應(yīng)用,為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作作出貢獻(xiàn)。