劉智慧，張 蓓

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；2.徐州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇徐州 221000

卵巢癌是一種相對(duì)罕見(jiàn)但病死率較高的婦科惡性腫瘤，70%的卵巢癌患者就診時(shí)已處于臨床晚期。雖然大多數(shù)患者經(jīng)過(guò)初始治療可獲得臨床緩解，但仍有70%的患者在3年內(nèi)復(fù)發(fā)，5年生存率不足50%[1-3]。二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)蛋白與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等多種生物學(xué)行為和患者預(yù)后情況密切相關(guān)，因而，ARF6蛋白被認(rèn)為是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的腫瘤診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)因子[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌組織中ARF6蛋白高表達(dá)，且與患者預(yù)后相關(guān)[6]，但ARF6蛋白在卵巢癌中的表達(dá)及對(duì)患者預(yù)后的評(píng)價(jià)作用尚不完全清楚。華蟾毒它靈(CINO)是從中藥蟾酥中提取的丁二烯內(nèi)酯,由蟾酥制成的中成藥，如華蟾素注射液、華蟾素膠囊等對(duì)卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌均有較好療效[7-8]。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，超過(guò)0.5 μmol/L的CINO可抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3、CRL1978和CRL11731的增殖、遷移和侵襲[9]，但其可能的作用機(jī)制，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本研究擬研究CINO抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的可能機(jī)制，以期為CINO用于卵巢癌治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2017年12月于徐州市中心醫(yī)院確診的45例新發(fā)卵巢癌患者納入癌癥組，均為接受手術(shù)治療并完成標(biāo)準(zhǔn)化療的漿液性卵巢癌患者，排除合并其他惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病、免疫疾病及失訪患者，年齡26～81歲，中位年齡54歲。選取因其他生殖器官病變接受手術(shù)的45例非卵巢癌患者納入對(duì)照組，均為因子宮肌瘤、腺肌癥、宮頸病變行子宮附件切除術(shù)的患者，年齡19～83歲，中位年齡51歲。兩組研究對(duì)象年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.281)。本研究經(jīng)徐州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開展，所有患者自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 人卵巢癌細(xì)胞 SKOV3 由徐州醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。ARF6蛋白多克隆抗體購(gòu)自Thermo Fisher公司，批號(hào)PA5-44191；兔超敏兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)PV-9001；McCoy′s 5a培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo Fisher公司，批號(hào)12330031；胎牛血清購(gòu)自Hyclone 公司，批號(hào)SH30396.03；CINO購(gòu)自Med Chem Express公司，批號(hào)1108-68-5；二 甲 基 亞 砜 (DMSO)購(gòu)自Aladdin 公司，批號(hào)D103277；二喹啉甲酸(BCA)蛋白水平檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime 公司，批號(hào) P0010；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自Beyotime公司，批號(hào)P0012A；ECL底物液購(gòu)自南京聚康醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)WBKLS0050。CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、MD Spectramac M3多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司，Power Supplies Basic電泳儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)170-4150購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化染色檢測(cè) 所有手術(shù)切除標(biāo)本固定完善，并進(jìn)行石蠟包埋，制作成4 μm的連續(xù)組織切片。嚴(yán)格按免疫組化染色檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書配制成1∶100的ARF6蛋白抗體，檢測(cè)組織切片中ARF6蛋白。每張切片均在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行閱片。以>10%癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色為ARF6蛋白陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，否則判定為陰性。以超過(guò)50%以上視野的判定結(jié)果為最終染色判斷結(jié)果。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人卵巢癌細(xì)胞SKOV3置于含雙抗及10%胎牛血清的McCoy′s 5a培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將CINO溶于DMSO中，設(shè)置0、0.5、1.0、2.0 μmol/L 4組藥物處理人卵巢癌細(xì)胞SKOV3 48 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè) 用適量胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞后，將其移至離心管中，加入配制好的冷裂解緩沖液振蕩離心取上清液，蛋白定量用BCA法。SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)1 h，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5～2.0 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次后，加入二抗(1∶8 000)，常溫孵育1 h，TBST洗滌3次后加入ECL顯色液于暗室中曝光，熒光采集圖像并分析。

1.3.4隨訪 隨訪所有患者至2020年12月30日，分析患者生存情況。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌組織與正常卵巢組織中ARF6蛋白表達(dá)差異 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，ARF6蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，卵巢癌組織中ARF6蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為53.33%(24/45)，而正常卵巢組織中ARF6蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率僅為15.56%(7/45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。進(jìn)一步分析卵巢癌的病理分級(jí)發(fā)現(xiàn)，低分化卵巢癌組織ARF6蛋白陽(yáng)性率為61.10%，中高分化卵巢癌組織ARF6蛋白陽(yáng)性率為48.10%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.393)。

注：A為卵巢癌組織中ARF6蛋白陽(yáng)性表達(dá)；B為卵巢癌組織中ARF6蛋白陰性表達(dá)；C為正常卵巢組織中ARF6蛋白陰性表達(dá)。圖1 不同卵巢組織中ARF6蛋白的表達(dá)(×200)

2.2ARF6蛋白的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 45例漿液性卵巢癌患者中，存活21例，死于腫瘤24例，3年生存率為53.33%。Kaplan-Meier生存分析顯示，ARF6蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率低于ARF6蛋白陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同ARF6蛋白表達(dá)情況患者的生存率分析

2.3不同水平CINO對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中ARF6蛋白表達(dá)的影響 采用0、0.5、1.0、2.0 μmol/L的CINO分別作用于人卵巢癌細(xì)胞SKOV3，各組細(xì)胞中ARF6蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.75±0.42、0.57±0.23、0.42±0.03、0.07±0.01，ARF6蛋白表達(dá)水平隨藥物水平增加而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同水平CINO對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中ARF6蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

蟾酥是由蟾蜍科中華大蟾蜍的干燥表皮和腺體分泌物提取，一直被認(rèn)為是具有解毒、消腫、止痛等功能的中藥成分。蟾酥具有明顯抑制腫瘤的作用，CINO作為蟾酥中的活性成分，其抗腫瘤活性也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[10]。EMAM等[11]分析了CINO對(duì)人淋巴瘤U937細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)CINO誘導(dǎo)了胱天蛋白酶依賴性凋亡，其研究初步揭示了CINO對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的內(nèi)在和外在途徑。在固有途徑中，CINO導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)下降，同時(shí)釋放細(xì)胞色素c和激活caspase-3，導(dǎo)致DNA片段化和細(xì)胞死亡。在外源性途徑中，CINO引起了跨膜蛋白FAS的上調(diào)，從而啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)的形成。DISC激活procaspase-8，導(dǎo)致caspase-3激活，隨后DNA斷裂，細(xì)胞死亡。

從藥用動(dòng)植物中提取的化合物已成為前沿醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)，這些化合物顯示出抗氧化、抗炎、抗增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特性，可以使癌癥患者獲益[12-13]。CINO影響不同的癌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，可能是卵巢癌的潛在治療藥物。

本研究結(jié)果表明，ARF6蛋白在漿液性卵巢癌中高表達(dá)，在不同病理分級(jí)卵巢癌組織中無(wú)明顯差異，但和患者的預(yù)后息息相關(guān)，ARF6蛋白高表達(dá)患者的預(yù)后情況較差。中藥成分CINO可以下調(diào)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中ARF6蛋白的表達(dá)。因此，筆者提出一種猜想：CINO抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖可能與其下調(diào)ARF6蛋白的表達(dá)有關(guān)。CINO是目前市面上廣泛用于癌癥的中藥成分，了解其作用機(jī)制對(duì)于抗癌及抑癌藥物的研發(fā)非常重要，但更為詳細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

由于組織標(biāo)本庫(kù)的局限性，本研究?jī)H選取漿液性卵巢癌進(jìn)行研究，更多病理類型卵巢癌及更大樣本的卵巢癌研究數(shù)據(jù)尚需進(jìn)一步探索。