勿坡巫且,鄧才洪,李伍基，楊 林，沈樹安，白子格

1.四川省涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川西昌 615000；2.成都大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川成都 610000

腦梗死屬于缺血性腦血管疾病，是最常見的疾病之一，嚴重危害人類健康，其具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高、復發(fā)率高等特點[1]。糖尿病和缺血性腦血管病常常伴發(fā)，腦梗死患者發(fā)病時合并糖尿病的約占20%[2]。糖尿病可增加腦梗死患者的病死率、致殘率和復發(fā)率[3]，因此推測糖尿病可能會促進腦梗死的發(fā)展與惡化。利拉魯肽是一種治療糖尿病的藥物，是人工合成的胰高血糖素樣肽(GLP-1)類似物，其同源序列與天然的GLP-1高度吻合[4]，具備天然GLP-1的各種生理作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可順利透過人體的血腦屏障[5]，與腦內(nèi)GLP-1受體(GLP-1R)相結(jié)合從而發(fā)揮抗炎、抗氧化應激等作用。本研究通過建立大腦中動脈缺血(MCAO)糖尿病大鼠模型，探討了利拉魯肽在糖尿病腦缺血中的抗炎作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 實驗動物為54只SPF級雄性SD大鼠，每只280～320 g，8～10周齡，購買于佛山市醫(yī)學實驗動物中心。

1.2實驗試劑 利拉魯肽注射液購自丹麥諾和諾德生物科技有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ)、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國Sigma公司；髓過氧化物酶(MPO)過氧化氫還原法檢測試劑盒、白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司；鼠源性抗體腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、兔源性抗體核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)購自美國Santa生物科技公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉生物科技有限責任公司。

1.3方法

1.3.1實驗分組 將54只雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分成數(shù)量相等的3個組，分別為假手術(shù)組(S組)、糖尿病合并腦缺血組(Di組)、利拉魯肽干預糖尿病合并腦缺血組(Li組)，每組18只。

1.3.2糖尿病大鼠模型的制作 參照制備糖尿病大鼠模型相關(guān)文獻[6]：Di組和Li組大鼠高脂高糖飲食喂養(yǎng)14 d后，對其禁食禁飲8 h以上，左側(cè)下腹部腔內(nèi)注射STZ 20 mg/kg，24 h后再次同部位注射STZ 35 mg/kg。密切動態(tài)觀察大鼠癥狀和體征變化，采用羅氏血糖儀測定尾尖靜脈血糖，若隨機血糖>16.9 mmol/L且伴有多飲、多尿、體質(zhì)量下降等表現(xiàn)判定為糖尿病大鼠模型制作成功(7 d內(nèi)判定)。S組大鼠腹腔注射等體積經(jīng)滅菌處理的枸椽酸/枸椽酸鈉緩沖液。Li組大鼠糖尿病模型制作成功后再給予利拉魯肽注射液100 μg/kg(每12小時給藥1次),連續(xù)注射7 d(包括MCAO手術(shù)日)。各組大鼠均連續(xù)監(jiān)測血糖14 d。

1.3.3MCAO模型制作 糖尿病大鼠模型制作成功后，Di組和Li組(給予利拉魯肽進行干預后)均采用Longa線栓法建立永久性MCAO模型。S組將線栓插入距頸內(nèi)外動脈分叉10.0～12.0 mm處，其余各組將線栓插入至頸動脈分叉處(18.0±0.5)mm(略感阻力為止)。

1.3.4神經(jīng)功能缺損評分及實驗動物剔除 根據(jù)文獻[5]進行評分：0分，無功能缺損體征；1分，不能伸展對側(cè)前爪子；2分，向病灶對側(cè)轉(zhuǎn)圈圈；3分，輕推鼠背時向癱瘓?zhí)巸A倒；4分，無自發(fā)活動和意識；5分，死亡。在模型制作后24 h進行神經(jīng)功能缺損評分，1～4分視為制模成功，0分和5分者剔除。

1.3.5TTC染色檢測腦梗死面積 MCAO模型建立48 h，隨機取各組大鼠6只進行麻醉斷頭取腦(在冰上進行)，腦組織置于-20 ℃冰箱中速凍10 min，將大腦平均冠狀切為5片，厚度約2 mm。置于2% TTC磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi)，37 ℃錫箔紙避光孵育30 min，翻面染色，正常腦組織會被染成紅色而梗死區(qū)不會被染色。4%多聚甲醛固定12 h，隨后拍照，照片采用Image J軟件進行分析，計算腦梗死面積百分比。

1.3.6腦組織MPO活性的檢測 MCAO模型建立48 h后，每組中隨機取6只大鼠，斷頭取腦，取缺血區(qū)腦組織(S組取手術(shù)側(cè))超聲波粉碎(30 s，3次)，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，保持溫度20～25 ℃，按試劑盒說明要求操作，取上清液于分光光度計下立即進行掃描，檢測吸光度，隨后按公式計算MPO的活性 。

1.3.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測腦組織中的IL-1β水平 MCAO術(shù)48 h麻醉斷頭取腦，取缺血區(qū)腦組織(S組取手術(shù)側(cè))，每組稱取100 mg,加入9倍體積4 ℃ 0.9%生理鹽水，用超聲波粉碎機將標本制成組織勻漿，置入冷凍離心機，以4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液用于檢測，按試劑盒的說明書進行操作，隨后在不同波長的分光光度儀中測定吸光度值。

1.3.8腦組織NF-κB和TNF-α蛋白的Western blot檢測 各組分別取6只大鼠腦缺血組織作為檢測標本，將所取標本與SDS裂解液按一定比例混合在冰上快速研磨10 min，用腦組織勻漿器反復勻漿，置于4 ℃冷凍離心機高速離心，以12 000 r/min離心5 min，收集離心完成的上清液提取總蛋白(NF-κB進行核蛋白提取)，應用標準的BCA法進行總蛋白定量。取處理好的樣品加入等體積2×電泳樣品緩沖液均勻混合，以每條泳道上樣20～25 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，用5%全脫脂奶粉(溶解于2×PBS)封閉，常溫下孵育1 h，加入與抗原相對應一抗[兔抗大鼠NF-κB(1∶600)或羊抗大鼠TNF-α(1∶500)]，在4 ℃搖床上緩慢搖振并孵育過夜；反復使用PBS-T(1 L PBS 中加入1 mL吐溫-20溶液)洗膜5次,每次10～12 min，隨即加入含HRP標記的二抗[山羊抗兔(1∶7 000)，兔抗山羊(1∶7 000)]，避光條件下常溫孵育1 h；反復使用PBS-T洗膜5次,每次10～12 min，用ECL顯色劑顯色，拍攝濾膜相片，用HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)進行膠帶圖像分析，獲取各組膠帶顯影的平均吸光度，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-Actin)吸光度比值作為目標蛋白的相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1各組的血糖水平的變化 S組注射前與注射后(監(jiān)測血糖第14天時)血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Di組、Li組注射后(監(jiān)測血糖第14天時)血糖水平均比注射前顯著升高(P<0.05)；Li組注射后(監(jiān)測血糖第14天時)血糖水平低于Di組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腹腔注射STZ或枸椽酸/枸椽酸鈉緩沖液前后血糖水平變化

2.2神經(jīng)功能缺損評分 Di組和Li組評分均高于S組(P<0.05)，Li組評分低于Di組(P<0.05)，見表2。

2.3腦梗死面積 TTC染色后S組無梗死區(qū)，其余組均有梗死區(qū)，見圖1。與S組比較，Di組和Li組的梗死面積百分比顯著增加(P<0.05)；與Di組比較，Li組的梗死面積減小(P<0.05)，見表2。

表2 各組神經(jīng)功能缺損評分及梗死面積百分比比較

圖1 術(shù)后各組48 h的TTC染色結(jié)果

2.4MPO活性的測定 Di組和Li組的腦組織MPO活性高于S組(P<0.05)；Li組MPO活性低于Di組(P<0.05)，見表3。

2.5ELISA檢測腦組織IL-1β水平 Di組和Li組腦組織IL-1β水平高于S組(P<0.05)；Li組腦組織IL-1β水平低于Di組(P<0.05)，見表3。

2.6Western blot檢測腦組織中的NF-κB和TNF-α蛋白表達水平 Di組和Li組的NF-κB、TNF-α蛋白相對表達水平高于S組(P<0.05)；與Di組比較，Li組的TNF-α、NF-κB蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 3組腦組織MPO活性、IL-1β水平及NF-κB、TNF-α相對表達水平比較

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可減少糖尿病腦缺血組織的梗死面積百分比和改善神經(jīng)功能缺損評分，顯著降低缺血腦組織中MPO的活性和IL-1β水平，可顯著下調(diào)NF-κB和TNF-α蛋白的表達水平。利拉魯肽具有抗炎作用，利拉魯肽下調(diào)上述炎性因子可能是保護糖尿病合并腦缺血患者神經(jīng)細胞的機制之一。

糖尿病是嚴重威脅人類健康的慢性疾病，易并發(fā)各類嚴重的血管疾病。曾有研究報道糖尿病是腦梗死發(fā)病或(和)預后不良的獨立危險因素之一[7]。本研究中，Di組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比Li組大鼠更高，梗死面積百分比更大，提示糖尿病是導致腦缺血病情加重的重要因素之一。

利拉魯肽為GLP-1長效類似物，由基因重組技術(shù)合成，半衰期為13 h，用于2型糖尿病患者的治療。有研究顯示，利拉魯肽可透過血腦屏障，與顱內(nèi)GLP-1R結(jié)合而發(fā)揮作用[8]。國外學者研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽有抗炎性反應的作用[9]。利拉魯肽能夠通過抗氧化和抗炎效應上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，顯著減輕大腦中動脈阻塞所致的腦缺血再灌注損傷[10]。利拉魯肽可通過抗炎、抗凋亡和抗氧化應激等作用，減少糖尿病大鼠腦缺血引起的神經(jīng)細胞損傷，是一個神經(jīng)保護劑[11]。本研究表明，利拉魯肽通過一系列抗炎性反應、抗氧化應激作用，可顯著減輕糖尿病模型大鼠的腦缺血損傷程度。MPO為中性粒細胞活化的標記物，其活性是評價中性粒細胞在組織中浸潤的關(guān)鍵指標[12]。本研究顯示，Di組和Li組腦組織MPO活性均較S組顯著升高，神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分比顯著增大，表明中性粒細胞浸潤與糖尿病合并腦缺血發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而利拉魯肽干預后MPO活性下降，神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分比均顯著降低，表明利拉魯肽具有降低MPO活性的作用，從而降低糖尿病合并腦缺血損傷的程度。

研究已證實NF-κB、TNF-α、IL-1β為促炎性細胞因子，在腦缺血發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，參與腦缺血損傷加重的過程[13]。IL-1β在炎癥啟動階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。NF-κB是真核細胞中尤為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其參與了眾多基因表達與調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后其表達顯著上調(diào)，隨后促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β也表達上調(diào)，從而加重炎性反應和腦缺血損傷，故通過抑制NF-κB蛋白表達可減輕腦缺血損傷。在本研究中，Di組NF-κB、TNF-α蛋白表達水平和IL-1β表達水平均較S組顯著增高，提示其參與了糖尿病腦缺血損傷的病理過程，利拉魯肽干預后NF-κBT、NF-α和IL-1β表達水平均顯著下調(diào)，相應的神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分比也降低，表明利拉魯肽減輕糖尿病腦缺血大鼠的神經(jīng)損傷可能與其下調(diào)炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-1β相關(guān)。

本研究表明，利拉魯肽對糖尿病腦缺血損傷者神經(jīng)功能的保護作用可能主要是通過下調(diào)炎性因子的表達水平實現(xiàn)的。因利拉魯肽廣泛應用于臨床治療，是治療糖尿病合并腦缺血的新途徑，本研究為探討利拉魯肽保護糖尿病腦缺血損傷者神經(jīng)細胞的作用機制明確了方向。