李 煒，羅 雄

四川省巴中市中心醫(yī)院泌尿外科,四川巴中 636001

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2012年，我國(guó)腫瘤登記地區(qū)報(bào)告，前列腺癌發(fā)病率為9.92/10萬(wàn)，占男性惡性腫瘤發(fā)病率的第6位[1]。目前，臨床普遍采用前列腺特異性抗原(PSA)作為前列腺癌的篩查及預(yù)后判斷指標(biāo)。但早在2014年，加拿大預(yù)防醫(yī)療護(hù)理專責(zé)小組就發(fā)布報(bào)告稱，PSA用于篩查前列腺癌弊大于利，假陽(yáng)性結(jié)果過(guò)多，應(yīng)放棄使用[2-3]。因此，臨床中迫切需要尋找到更多新的高敏感性及特異性的標(biāo)志物。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，目前的研究表明，miRNA幾乎參與了所有的細(xì)胞生物活動(dòng)[4-5]。有研究表明，miR-1246在某些腫瘤組織中表達(dá)水平明顯升高[6-7]，但關(guān)于血清miR-1246水平對(duì)前列腺癌患者的研究報(bào)道較少。因此，本研究收集了88例行手術(shù)治療的前列腺癌患者為研究對(duì)象，探討外周血miR-1246表達(dá)對(duì)患者臨床特征的影響及對(duì)患者預(yù)后判斷的價(jià)值，以期為前列腺的早診斷、早干預(yù)提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月至2016年1月巴中市中心醫(yī)院收治的前列腺癌患者作為前列腺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)泌尿外科學(xué)分會(huì)(CUA)編寫(xiě)的《中國(guó)前列腺癌診斷治療指南》中有關(guān)前列腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)均行根治性手術(shù)；(3)首次診斷并治療；(4)術(shù)前未行放化療、內(nèi)分泌治療等；(5)病歷資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)前列腺癌復(fù)發(fā)患者。(2)合并其他急慢性感染性疾病。(3)合并全身其他系統(tǒng)的惡性腫瘤。最終，88例患者被納入前列腺癌組。同時(shí)，選取同期行手術(shù)治療的62例單純性前列腺增生患者作為增生組，以及60例健康志愿者為健康對(duì)照組。向患者或志愿者詳細(xì)說(shuō)明本研究的目的，納入研究者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2試劑與儀器 總RNA快速抽提試劑盒購(gòu)于杭州艾康生物技術(shù)有限公司，Trizol總RNA抽提試劑購(gòu)于美國(guó)智雅生物技術(shù)有限公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)于日本Takara公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，PCR引物由武漢博士德生物科技公司合成。

1.3方法

1.3.1外周血miR-1246的檢測(cè) 患者入院后，抽取肘正中靜脈血5 mL，3 000 r/min條件下離心5 min，分離血漿后低溫凍存，健康志愿者血液標(biāo)本采集方法及步驟相同。參照說(shuō)明書(shū)提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度與純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-1246的相對(duì)表達(dá)水平。PCR中miR-1246的上游引物為5′-CCTACATCGCACCGGAGTCTG-3′，下游引物為5′-GCGAGCACAGAACATAATACGAC-3′；U6的上游引物為5′-CTCGCTACGCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTFCACGAAT TTGCGAT-3′。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，總計(jì)40個(gè)循環(huán)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。以U6作為內(nèi)參基因，得到Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算外周血miR-1246相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2隨訪 采用門診形式進(jìn)行定期隨訪。術(shù)后第6周第一次門診檢測(cè)血清PSA，此后每3個(gè)月門診隨訪一次，之后每半年隨訪一次。直至隨訪終點(diǎn)或失訪，隨訪截止時(shí)間為2020年1月31日。以術(shù)后生化復(fù)發(fā)為主要隨訪終點(diǎn)，術(shù)后無(wú)生化復(fù)發(fā)定義為根治性手術(shù)后PSA降至最低值后，連續(xù)兩次PSA高于0.2 ng/mL。

2 結(jié) 果

2.1miR-1246在3組人群中的表達(dá)水平比較 以U6為內(nèi)參基因，miR-1246在前列腺癌組、增生組、健康對(duì)照組人群中的相對(duì)表達(dá)水平分別為2.62±0.89、1.35±0.51、1.25±0.48，兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組的miR-1246表達(dá)水平顯著高于增生及健康對(duì)照組(P<0.05)，但增生組與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2miR-1246表達(dá)水平對(duì)患者臨床、病理特征的影響 miR-1246表達(dá)水平對(duì)患者Gleason評(píng)分、T分期、N分期、M分期、危險(xiǎn)因素分級(jí)有明顯不良影響(P<0.05)，但與年齡、PSA水平無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 miR-1246表達(dá)水平對(duì)患者臨床病理參數(shù)的影響

續(xù)表1 miR-1246表達(dá)水平對(duì)患者臨床病理參數(shù)的影響

2.3miR-1246對(duì)前列腺癌的潛在診斷價(jià)值評(píng)估 ROC曲線顯示，miR-1246、PSA對(duì)診斷前列腺癌的最佳截?cái)嘀捣謩e為2.54、11.5 ng/mL。PSA對(duì)診斷前列腺癌的特異度、靈敏度、準(zhǔn)確率分別為72.9%、62.1%、64.2%；miR-1246為47.9%、91.3%、82.7%，二者聯(lián)合診斷時(shí)，特異度有所下降，但準(zhǔn)確率明顯上升。見(jiàn)表2。

表2 三種檢測(cè)方式對(duì)肺癌的診斷效能

2.4miR-1246對(duì)前列腺癌患者總體生存率及無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率影響 miR-1246相對(duì)表達(dá)水平的中位值為2.50，相對(duì)表達(dá)水平≤2.50為低表達(dá)組，相對(duì)表達(dá)水平>2.50為高表達(dá)組，Kaplan-Meier生存分析顯示，兩組患者的總體生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.429，P=0.232)，但低表達(dá)組患者的無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率顯著高于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.26，P=0.039)。見(jiàn)圖1。

注：A為總體生存率；B為無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率。

2.5影響前列腺癌患者總體生存期及無(wú)生化復(fù)發(fā)期的危險(xiǎn)因素分析 Cox分析結(jié)果顯示，miR-1246表達(dá)水平、Gleason評(píng)分、術(shù)前PSA水平、病理分期是影響患者無(wú)生化復(fù)發(fā)期的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素(P<0.05)。單因素分析顯示，miR-1246表達(dá)水平、術(shù)前PSA水平、年齡是影響患者總體生存期的危險(xiǎn)因素，但僅有年齡是獨(dú)立性危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 影響前列腺癌患者總體生存期及無(wú)生化復(fù)發(fā)期的危險(xiǎn)因素分析

續(xù)表3 影響前列腺癌患者總體生存期及無(wú)生化復(fù)發(fā)期的危險(xiǎn)因素分析

3 討 論

前列腺癌的發(fā)病率在各個(gè)國(guó)家、各種族間有明顯差異，同一民族居住不同地區(qū)發(fā)病率可相差幾倍，由此認(rèn)為環(huán)境、生活方式對(duì)前列腺癌的發(fā)病有重大影響[8]。從形成腫瘤細(xì)胞發(fā)展到臨床出現(xiàn)腫瘤癥狀往往要經(jīng)過(guò)10～20年，如果能在早期識(shí)別前列腺癌的高危因素，普及特異性更高的篩查方式，則有可能降低前列腺癌的發(fā)病率或提高早期診斷率[9]。

miRNA廣泛地參與了細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)。miR-1246是一種較為特殊的miRNA，可參與調(diào)控血管生成、腫瘤發(fā)生、血管壁纖維化等過(guò)程，更為特殊的是，在不同類型的腫瘤中可表現(xiàn)出抑瘤或促瘤的雙向功能性，發(fā)揮類腫瘤基因或抑瘤因子作用[7,10]。前列腺癌中差異表達(dá)的miRNA已經(jīng)被確定，這些miRNA的表達(dá)與雄激素信號(hào)以及臨床病理因素有關(guān)。鑒于miRNA具有致癌或腫瘤抑制功能，miRNA可能成為癌癥藥物治療的新競(jìng)爭(zhēng)者。本研究中，miR-1246在前列腺癌組、增生組、健康對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)水平分別為2.62±0.89、1.35±0.51、1.25±0.48，兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者的miR-1246相對(duì)表達(dá)水平顯著高于前列腺增生組及健康對(duì)照組，但前列腺增生組與健康對(duì)照組的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。這表明，miR-1246在前列腺癌組織中表達(dá)水平顯著上升，這與多種癌癥類型中過(guò)表達(dá)一致[6,11]。進(jìn)一步分析了miR-1246表達(dá)水平對(duì)患者臨床、病理參數(shù)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-1246表達(dá)水平對(duì)患者Gleason評(píng)分、T分期、N分期、M分期、危險(xiǎn)因素分級(jí)有明顯影響。這表明miR-1246高表達(dá)可能參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

前列腺癌生化復(fù)發(fā)是指行根治性治療后，患者血清PSA水平再次升高，目前通常將根治性手術(shù)后PSA≥0.4 ng/mL，或根治性放療后在PAS最低值基礎(chǔ)上PSA水平上升超過(guò)0.2 ng/mL定義為前列腺癌復(fù)發(fā)[12-13]。生化復(fù)發(fā)是前列腺癌進(jìn)展為臨床局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的強(qiáng)烈信號(hào)，需要進(jìn)一步行全面評(píng)估，以判斷是否已發(fā)生臨床復(fù)發(fā)[14]。與單純生存率相比，生化復(fù)發(fā)預(yù)警檢測(cè)對(duì)疾病更具治療意義。在本研究中，通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，低miR-1246表達(dá)組患者的無(wú)生化復(fù)發(fā)生存期顯著高于高表達(dá)組。同時(shí)，Cox多因素分析也發(fā)現(xiàn)，miR-1246表達(dá)水平是影響患者無(wú)生化復(fù)發(fā)期的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。這表明，miR-1246表達(dá)水平是影響前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，可作為早期預(yù)測(cè)的指標(biāo)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-1246的高表達(dá)對(duì)前列腺癌患者的臨床病例特征有一定的不良影響，且與患者的生化復(fù)發(fā)密切相關(guān)，有成為預(yù)測(cè)患者預(yù)后指標(biāo)的可能。但本研究為單中心研究，樣本量尚小，未來(lái)將在多中心研究的基礎(chǔ)上實(shí)施更大樣本量的研究，或能得出更具說(shuō)服力的結(jié)論。