張余良,鄧國慶，劉術(shù)舟，周安燕

海南省人民醫(yī)院/海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院:1.耳鼻咽喉頭頸外科;2.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，海南?？?570311

鼻咽癌是我國南方發(fā)病率極高的惡性腫瘤[1]，癌基因和抑癌基因平衡紊亂是鼻咽癌發(fā)病的重要因素。在鼻咽癌高發(fā)地區(qū)，約70%的鼻咽癌患者確診時已經(jīng)處于晚期。盡管鼻咽癌的診斷和治療已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但約30%的高?；颊叽嬖趶?fù)發(fā)的風(fēng)險[2]。由于鼻咽癌的解剖位置較隱蔽且腫瘤細(xì)胞對射線較敏感，放療仍是鼻咽癌的首選治療方式。鼻咽癌5年生存率為87%～96%[3]。進(jìn)一步探討鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制對提高鼻咽癌治療效果具有重要的意義。微小RNA(miRNA)為一類小分子RNA，可與靶基因mRNA結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[4-5]。鼻咽癌進(jìn)展過程中存在多種miRNA的異常表達(dá)[6-7]。miR-1265是新近發(fā)現(xiàn)的小RNA分子,其在胃癌[8]、結(jié)直腸癌[9]及肺腺癌[10]中表達(dá)上調(diào)，同時血漿miR-1265可能是卵巢癌術(shù)后復(fù)發(fā)的標(biāo)志物[11]。本研究旨在探討miR-1265在鼻咽癌組織中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年8月在本院耳鼻喉頭頸外科住院治療的鼻咽癌患者60例作為研究組。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡35～75歲；(2)具有詳細(xì)的病歷和隨訪資料；(3)病理診斷為鼻咽癌；(4)除鼻咽癌外不存在其他惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前存在嚴(yán)重心血管疾病或惡病質(zhì)患者；(2)不愿意配合研究或無法配合者。研究組包括男34例、女26例，年齡44～74歲、平均(55.8±11.3)歲。選取同期于本院治療的鼻咽部良性腫瘤患者共60例作為對照組，疾病類型包括鼻腔乳頭狀瘤(24例)、纖維瘤(20例)、血管瘤(3例)及鼻息肉(13例)。對照組包括男30例、女30例，年齡36～67歲、平均(52.3±12.1)歲。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無惡性腫瘤病史；(2)鼻咽部CT或MRI檢查無惡性腫瘤；(3)病理學(xué)檢查符合鼻咽部良性腫瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)與研究組相同。所有納入研究的患者均經(jīng)過電子鼻咽鏡檢查并采集組織標(biāo)本，獲得病理學(xué)確診，TNM分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第8版標(biāo)準(zhǔn)[13]。兩組患者年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma 公司；細(xì)胞裂解液和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；超速離心機(jī)購自美國Sigma公司；PCR儀購自美國Bio-Rad 公司;酶標(biāo)儀購自上海賽默飛世爾公司。組織和血清RNA提取試劑盒、Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miR-1265 抑制劑和空白對照的干擾RNA、All-in-oneTMmiRNA qPCR 檢測試劑盒、MAT1 mRNA qPCR 檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司。雙熒光素酶報告基因分析實驗檢測試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)公司。

1.3方法

1.3.1兩組患者的血液和組織標(biāo)本收集 兩組患者于入院后次日抽取上肢靜脈血10 mL，離心后保存于-20 ℃冰箱待測。研究組的鼻咽癌組織標(biāo)本(60例)和對照組的鼻咽部良性腫瘤組織標(biāo)本(60例)保存于-80 ℃冰箱待測。

1.3.2兩組患者組織和血清中miR-1265的相對表達(dá)水平檢測 將兩組患者組織標(biāo)本勻漿用于RNA提取，血清標(biāo)本直接用于提取RNA,采用Trizol試劑提取組織或血清中的總RNA。用紫外分光光度計于260 nm和280 nm波長處測定RNA提取液的吸光度(A)值，檢測RNA純度和濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，分別將2 μg RNA、1 μL Oligo(dT)和8 μL DEPC 水加入PCR 管中，微型離心機(jī)離心后混勻，按試劑盒說明書所列方法配制PCR反應(yīng)體系：每組體系加入10 μL RNA模板，總體系為25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。miR-1265的相對表達(dá)水平檢測采用All-in-oneTMmiRNA qPCR 檢測試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，以U6作為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCT法計算miRNA的相對表達(dá)水平。

1.3.3靶基因預(yù)測 通過miRNA靶基因在線預(yù)測網(wǎng)站TargetScan預(yù)測miR-1265的靶基因，其原理是通過查找Mer位點與miRNA的種子區(qū)域的匹配來預(yù)測靶基因。

1.3.4miR-1265靶基因的驗證 及雙熒光素酶報告基因分析實驗按試劑盒操作手冊進(jìn)行。簡要步驟如下：取生長良好的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞(來自于本實驗室培養(yǎng)的細(xì)胞系)，分別轉(zhuǎn)染miR-1265 抑制劑(miR-1265 inhibator)和抑制劑的空白對照，在轉(zhuǎn)染miR-1265 inhibator后的細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染含有轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(MAT1)-3 UTR 野生型和突變型的質(zhì)粒，檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的相對活性。

1.3.5兩組患者組織中MAT1 mRNA的相對表達(dá)水平檢測 兩組患者病理組織中RNA提取和檢測方法同1.3.2，上下游引物分別為：5′-ACCTACAACCGATAGCTGCTG-3′和5′-TTCCGATCTGCTTGTACTGCA-3′。GAPDH為內(nèi)參基因，應(yīng)用2-ΔΔCT法計算MAT1 mRNA的相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者病理組織和血清中miR-1265相對表達(dá)水平的比較 研究組病理組織中miR-1265相對表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；研究組血清中miR-1265相對表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者病理組織和血清中miR-1265相對表達(dá)水平的比較

2.2鼻咽癌患者癌組織中miR-1265的相對表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系 不同性別、年齡及病理類型患者間miR-1265的相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同TNM分期、病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-1265相對表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 鼻咽癌患者癌組織中miR-1265相對表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系

2.3組織和血清中miR-1265的相對表達(dá)水平對鼻咽癌的診斷價值 當(dāng)病理組織中miR-1265截斷值為0.895時，Youden指數(shù)最大，其診斷鼻咽癌的ROC曲線AUC為0.917，95%CI為0.878～0.946，靈敏度為87.3%，特異度為91.3%；當(dāng)血清中miR-1265截斷值為0.515時，Youden指數(shù)最大，其診斷鼻咽癌的ROC曲線AUC為0.717，95%CI為0.678～0.806，靈敏度為67.3%，特異度為71.3%，見圖1。

圖1 鼻咽癌患者組織和血清中miR-1265的相對表達(dá)水平診斷鼻咽癌的ROC曲線

2.4MAT1基因是miR-1265的靶基因 通過TargetScan尋找miR-1265的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAT1 3′-UTR的835-845處含有保守的miR-1265同源位點，提示在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的癌基因MAT1是miR-1265的靶基因，見圖2A；雙熒光素酶報告基因分析實驗顯示：轉(zhuǎn)染MAT1野生型3′-UTR載體在miR-1265 inhibitor 刺激下螢火蟲熒光素與海腎熒光素的比值明顯下降(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染MAT1突變型3′-UTR載體在miR-1265 inhibitor刺激下螢火蟲熒光素與海腎熒光素的比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，MAT1為miR-1265的靶基因，見圖2B。

2.5研究組和對照組中MAT1 mRNA 表達(dá)水平比較 研究組病理組織中MAT1 mRNA相對表達(dá)水平為0.731±0.311，對照組為2.413±0.425，研究組病理組織中MAT1 mRNA相對表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.498,P<0.001)。

注：A表示miR-1265與預(yù)測靶點MAT1的結(jié)合位點；B表示雙熒光素酶報告基因分析實驗驗證miR-1265與MAT1的靶向結(jié)合；*表示P<0.05。

2.6MAT1 mRNA 和miR-1265的相關(guān)性 Pearson相關(guān)顯示鼻咽癌組織中MAT1 mRNA與miR-1265的相對表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.943,P<0.001),見圖3。

圖3 鼻咽癌患者癌組織中MAT1 mRNA 和miR-1265的相對表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討 論

鼻咽癌好發(fā)于我國南方地區(qū)，發(fā)病率在頭頸惡性腫瘤中居首位，以低分化鱗癌為主[14]。鼻咽癌早期癥狀復(fù)雜多樣缺乏特異性，腫瘤部位常較為隱蔽，導(dǎo)致早期檢出率較低，約為60%。鼻咽癌患者確診時已經(jīng)發(fā)生腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療效果不佳，嚴(yán)重影響患者的生存[15]，探討鼻咽癌發(fā)病機(jī)制和新的診斷方法對改善鼻咽癌患者預(yù)后意義重大。

miRNA是真核細(xì)胞內(nèi)無編碼作用的小RNA，僅由19～25個核苷酸序列組成，在腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷移、增殖等過程中發(fā)揮調(diào)控作用[16]。miR-1265是最新鑒定的微小RNA，在結(jié)直腸癌高通量測序中發(fā)現(xiàn)其在癌組織中表達(dá)水平高于癌旁組織[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)在胃癌患者癌組織中 miR-1265相對表達(dá)水平較癌旁組織上調(diào)，其血清中miR-1265相對表達(dá)水平也高于健康人群[8]，體外研究發(fā)現(xiàn)miR-1265表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制癌細(xì)胞凋亡，減弱癌細(xì)胞中自噬蛋白表達(dá)，促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，發(fā)揮致癌基因的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌癌組織中miR-1265相對表達(dá)水平較鼻咽部良性腫瘤組織顯著上調(diào)，同時鼻咽癌患者血清中miR-1265相對表達(dá)水平也高于鼻咽部良性腫瘤患者，提示其可能在鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中miR-1265的相對表達(dá)水平與TNM分期、病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤的臨床病理特征相關(guān)，其中TNM分期越晚、病理分期為進(jìn)展型和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中miR-1265的相對表達(dá)水平較高，提示miR-1265 可能參與鼻咽癌進(jìn)展，而miR-1265 的相對高表達(dá)代表鼻咽癌患者癌細(xì)胞存在較晚的臨床分期、較高侵襲性及惡性程度。

鼻咽部腫瘤良惡性的鑒別診斷一直是臨床研究的熱點[17]。 鼻咽癌腫瘤部位常較隱蔽，診斷缺乏特異性，同時鼻咽部存在多種良性腫瘤，常導(dǎo)致鼻咽癌易漏診和鼻咽癌早期檢出率較低[18]。本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中miR-1265的相對表達(dá)水平可有效區(qū)分鼻咽癌和鼻咽部良性腫瘤，其診斷的AUC為0.917，靈敏度為87.3%，特異度為91.3%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌血清中的miR-1265診斷鼻咽癌的AUC為0.717，靈敏度為67.3%，特異度為71.3%，有一定的診斷價值，且血清miR-1265 的相對表達(dá)水平不需要取得活檢組織，具有成為鼻咽癌無創(chuàng)診斷標(biāo)志物的潛能[19]。

MAT1基因是常見的致癌基因，其高表達(dá)與多種癌癥發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[20]。MAT1 基因位于14q23.1 位點上，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶7 (CDK7) 和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶H(CDKH)發(fā)揮作用，其高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，且與乳腺癌預(yù)后密切相關(guān)[21]。在其他癌癥中，如結(jié)直腸癌[22]和非小細(xì)胞肺癌[23]癌組織標(biāo)本中的MAT1 基因表達(dá)水平有助于不良預(yù)后的判斷，且MAT1 基因可能成為潛在的癌癥治療靶點。最新研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中MAT1 mRNA 和蛋白均在癌組織中低表達(dá)，而在癌旁組織中高表達(dá)，且可用于判斷鼻咽癌的不良預(yù)后，提示MAT1 基因參與了鼻咽癌的進(jìn)展[24]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1265的潛在靶基因是MAT1，采用雙熒光素報告基因分析實驗驗證miR-1265潛在的靶基因是MAT1基因，而且鼻咽癌患者癌組織中MAT1 mRNA 的相對表達(dá)水平低于鼻咽部良性腫瘤患者，鼻咽癌患者癌組織中MAT1 mRNA 的相對表達(dá)水平與miR-1265相對表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1265的靶基因是MAT1 基因，是否可通過敲低miR-1265表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)MAT1 基因表達(dá)而治療鼻咽癌尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者癌組織和血清中miR-1265表達(dá)上調(diào)，與鼻咽癌進(jìn)展密切相關(guān)，且具有鑒別診斷鼻咽癌和鼻咽部良性腫瘤的能力，其靶基因是MAT1基因，且鼻咽癌組織中miR-1265相對表達(dá)水平與MAT1呈負(fù)相關(guān)。miR-1265和MAT1基因有應(yīng)用于鼻咽癌診斷的潛在價值或成為鼻咽癌治療的新靶點。