辛燕花，趙三虎，王瑜，陳柯文，梁雅婷，閆娜，趙春艷，張建華，吳承甍

（1.忻州師范學(xué)院，山西 忻州 034000；2.廣州萬物生健康產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 廣州 510642；3.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）原產(chǎn)于歐亞大陸，在海拔2 500 m～4 300 m的許多國家都有栽培[1]。沙棘中含有豐富的維生素、胡蘿卜素、微量元素、氨基酸等生物活性物質(zhì)[2-4]。因此，沙棘已被臨床用于治療輻射損傷、燒傷、口腔炎癥、胃潰瘍等疾病[5-7]。沙棘葉含有豐富的活性物質(zhì)[8]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)[9]、抗應(yīng)激和炎癥[10]的活性功能。目前，針對沙棘葉中的活性成分提取分離研究較多，不同的提取劑對沙棘葉中的活性物質(zhì)及抗氧化性的影響尚未見報(bào)道。

本文采用羥基自由基、超氧陰離子自由基和還原力3種體外抗氧化模型對沙棘葉甲醇提取物以及水相、丙酮相、乙醇相和乙酸乙酯相等5個(gè)極性部位的抗氧化活性進(jìn)行研究，并測定其總多糖、總黃酮、總有機(jī)酸、抗壞血酸和氨基酸含量，進(jìn)行相關(guān)性分析，為沙棘葉資源開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘葉：采摘于山西龐泉溝風(fēng)景區(qū)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10N真空冷凍干燥機(jī)：北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；YZH-92A水浴恒溫振蕩器：江西省生物儀器制造有限公司；752紫外分光光度計(jì)：上海精研電子科技有限公司；LH-4035低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘葉處理

將沙棘嫩葉放置在真空冷凍干燥機(jī)中，冷阱溫度-40℃，真空度20 Pa、加熱板溫度10℃。冷凍干燥10 h至質(zhì)量不變，粉碎備用。

1.3.2 樣液制備

稱取沙棘葉 2.0 g，按照料液比 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）加入一定體積雙蒸水，50 ℃恒溫水浴1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，獲得沙棘葉的水提取溶液。按照同樣的方法，制備甲醇提取溶液、乙醇提取溶液、乙酸乙酯提取溶液和丙酮提取溶液，備用。

1.3.3 總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，在510 nm處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.92x+0.0218，R2=0.9915。

1.3.4 總多糖含量的測定

總多糖含量的測定參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，在489 nm處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=3.446 4x-0.001 6，R2=0.999 7。

1.3.5 氨基酸含量的測定

氨基酸含量的測定參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行，以谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，在570 nm處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=4.498 9x-0.034 9，R2=0.999 2。

1.3.6 總有機(jī)酸含量的測定

總有機(jī)酸含量的測定參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，在730 nm處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=1.987x+0.005 2，R2=0.999 7。

1.3.7 抗壞血酸含量的測定

抗壞血酸含量的測定參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行，以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，在244 nm處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為 y=0.061 5x-0.015 3，R2=0.999 8。

1.3.8 抗氧化能力測定

超氧陰離子自由基清除能力、羥基自由基清除能力、還原能力測定參照文獻(xiàn)[16-18]進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPPS Statistics 21軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物含量分析

2.1.1 總黃酮含量分析

不同提取劑對沙棘葉總黃酮含量的影響見圖1。

圖1 不同提取劑對沙棘葉中總黃酮含量的影響Fig.1 Effects of different extracts on the content of total flavonoids in seabuckthorn leaves

由圖1可以看出，用不同的提取劑提取沙棘葉中的總黃酮，總黃酮含量差異性較大，同一種提取劑在不同的料液比下，總黃酮含量也呈現(xiàn)出明顯的差異。從圖1可以看出，相比其它4種提取劑，用甲醇作為提取劑，提取出沙棘葉中的總黃酮含量最高，其次是水>丙酮>無水乙醇>乙酸乙酯。

提取劑相同時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的總黃酮含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當(dāng)以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，總黃酮的含量最高，為（64.26±1.38）mg/g。

2.1.2 總多糖含量分析

對沙棘葉的總多糖含量進(jìn)行測定分析，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取劑對沙棘葉中總多糖含量的影響Fig.2 Effects of different extracts on the content of total polysaccharide in seabuckthorn leaves

由圖2可以看出，用不同的提取劑提取沙棘葉中的總多糖，總多糖含量差異性較大，同一種提取劑在不同的料液比下，總多糖含量也呈現(xiàn)出明顯的差異。相比其它4種提取劑，用甲醇作為提取劑，提取出沙棘葉中的總多糖含量最高。

提取劑相同時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的總多糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當(dāng)以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，總多糖含量為（19.84±0.64）mg/g。

2.1.3 氨基酸含量分析

不同提取劑對沙棘葉氨基酸含量的影響見圖3。

圖3 不同提取劑對沙棘葉中氨基酸含量的影響Fig.3 Effects of different extracts on the content of amino acids in seabuckthorn leaves

由圖3可知，沙棘葉中氨基酸含量受提取劑的影響也較大，用不同的提取劑提取沙棘葉中的氨基酸，氨基酸含量差異明顯。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，得到的氨基酸含量也呈現(xiàn)出明顯的差異。相比其它4種提取劑，用甲醇作為提取劑，提取出沙棘葉中的氨基酸含量最高，其次是水>丙酮>無水乙醇>乙酸乙酯。

提取劑相同時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的氨基酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當(dāng)以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，氨基酸含量為（7.41±0.07）mg/g。

2.1.4 總有機(jī)酸含量分析

對沙棘葉總有機(jī)酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。

圖4 不同提取劑對沙棘葉中總有機(jī)酸含量的影響Fig.4 Effects of different extracts on the content of total organic acids in seabuckthorn leaves

沙棘葉總有機(jī)酸含量的變化隨著提取劑的不同，呈現(xiàn)出明顯的差異。從圖4可以看出，提取劑對沙棘葉總有機(jī)酸含量的變化有很大的影響。呈現(xiàn)出的大致規(guī)律是甲醇>水>丙酮>無水乙醇>乙酸乙酯。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，得到的總有機(jī)酸含量也呈現(xiàn)出明顯差異。

提取劑相同時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的總有機(jī)酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當(dāng)以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，總有機(jī)酸含量為（3.45±0.05）mg/g。

2.1.5 抗壞血酸含量分析

對沙棘葉中的抗壞血酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖5。

圖5 不同提取劑對沙棘葉中抗壞血酸含量的影響Fig.5 Effects of different extracts on the content of ascorbic acid in seabuckthorn leaves

沙棘葉中抗壞血酸含量隨著不同提取劑及料液比的不同而呈現(xiàn)出顯著的變化。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，得到的抗壞血酸含量也呈現(xiàn)出顯著性的差異。

提取劑相同時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑提取出的抗壞血酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在料液比為 1∶5（g/mL）和 1∶10（g/mL）時(shí)，以甲醇作為提取劑得到的抗壞血酸含量較高，隨著提取溶劑的增加，以水作為提取劑得到的抗壞血酸含量較高。其中，當(dāng)以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，抗壞血酸含量為（95.55±0.18）mg/g。

2.2 不同溶劑提取物抗氧化能力分析

2.2.1 羥基自由基清除能力測定

提取劑對沙棘葉羥基自由基清除能力的影響見圖6。

圖6 不同提取劑對沙棘葉中羥基自由基清除率的影響Fig.6 Effects of different extracts on the hydroxyl radical scavenging in seabuckthorn leaves

如圖6所示，不同提取劑對沙棘葉羥基自由基清除能力的影響不同。羥基自由基清除能力呈現(xiàn)出的大致規(guī)律是甲醇>水>丙酮>無水乙醇>乙酸乙酯。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，羥基自由基清除能力也呈現(xiàn)出顯著性的差異。

提取劑相同時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑對羥基自由基清除能力影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當(dāng)以甲醇作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，羥基自由基清除率為（89.37±0.10）%。

2.2.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

提取劑對超氧陰離子自由基的清除能力的影響見圖7。

圖7 不同提取劑對沙棘葉中超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.7 Effects of different extracts on the superoxide anion radical scavenging in seabuckthorn leaves

如圖7所示，不同提取劑對沙棘葉超氧陰離子自由基清除能力的影響不同。超氧陰離子自由基清除能力呈現(xiàn)出的大致規(guī)律是丙酮>水>甲醇>無水乙醇>乙酸乙酯。其中，同一種提取劑采用不同的料液比，超氧陰離子自由基清除能力也呈現(xiàn)出明顯的差異。

提取劑相同時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑對超氧陰離子自由基清除能力的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，當(dāng)丙酮作為提取劑，在料液比為 1∶10（g/mL）時(shí)，超氧陰離子自由基清除率為（98.28±0.00）%。

2.2.3 還原力測定

還原力受提取劑的影響見圖8。

從圖8可以看出，沙棘葉提取物還原力的大小隨著提取劑的不同而不同。其中，以甲醇和水作為提取劑時(shí)，還原力較為接近。在料液比1∶5（g/mL）和1∶10（g/mL）時(shí)，以丙酮作為提取劑，測定得到的還原力與甲醇和水作為提取劑時(shí)較為相近，隨著料液比的增加，還原力逐漸下降，低于以水和甲醇作為提取劑測定得到的還原力。

提取劑相同時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，5種提取劑對還原力大小的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在沙棘葉原料與提取劑的比值為1∶10（g/mL）處達(dá)到最高。其中，當(dāng)丙酮作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，還原力為 0.85±0.01。

2.3 提取物含量與抗氧化性相關(guān)性分析

對提取物與抗氧化相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1 沙棘葉抗氧化性與活性物質(zhì)含量相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between antioxidant capacity and active components of seabuckthorn leaves

續(xù)表1 沙棘葉抗氧化性與活性物質(zhì)含量相關(guān)系數(shù)Continue table 1 Correlation coefficient between antioxidant capacity and active components of seabuckthorn leaves

由表1可見，沙棘葉各極性部位對還原力、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力與提取物中不同物質(zhì)含量均顯示正相關(guān)。

各極性部位還原力與總多糖、總黃酮、抗壞血酸和總有機(jī)酸含量顯示相關(guān)性較高。各極性部位羥基自由基清除能力與總黃酮和總有機(jī)酸的含量顯示相關(guān)性較高。各極性部位超氧陰離子自由基清除能力與抗壞血酸的含量顯示相關(guān)性較高。綜合提取物不同物質(zhì)和抗氧化性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇、水和丙酮部位抗氧化活性最好，總多糖、總黃酮、抗壞血酸和總有機(jī)酸等含量也較高。由此表明，沙棘葉抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是總多糖、總黃酮、抗壞血酸和總有機(jī)酸等物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

沙棘葉活性物質(zhì)的含量受到不同提取劑及料液比的影響，本研究結(jié)果表明，沙棘葉中的總黃酮、總多糖、總有機(jī)酸、抗壞血酸和氨基酸含量都是在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，溶劑對沙棘葉中活性物質(zhì)的溶解已基本達(dá)到飽和，繼續(xù)增加溶劑的用量，并不能顯著提高活性物質(zhì)的提取量。有研究者研究菠蘿蜜果皮總黃酮的提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，料液比對黃酮得率的影響很大，隨料液比增大，黃酮提取率逐漸增大，持續(xù)增大料液比，黃酮提取率反而降低。因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，料液比增大利于增加溶劑和原料的接觸效果，增大濃度差，加快溶劑擴(kuò)散，從而提高黃酮浸出率；而當(dāng)料液比過大時(shí)，黃酮溶出量達(dá)到飽和，而其它雜質(zhì)溶出增多，反而降低了黃酮提取率[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)溶劑對沙棘葉活性物質(zhì)有明顯的影響，多數(shù)研究文獻(xiàn)也證實(shí)了活性物質(zhì)的提取率受提取劑的影響較大。有研究者指出，沙棘葉中的蘆?。S酮類物質(zhì)）含量受到不同溶劑的影響，沙棘葉中水提物蘆丁的提取量和提取率都低于醇提物[20]。沙棘葉中粗多糖提取率隨著提取劑的不同，得率也不相同，有文獻(xiàn)報(bào)道，采用乙酸乙酯、甲醇、蒸餾水提取沙棘粗多糖，得率分別為1.52%、1.71%和2.41%，比水提取得到的多糖得率要高[21]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果有區(qū)別。趙玉琪等研究者[22]對沙棘葉黃酮的提取研究發(fā)現(xiàn)，甲醇水溶液的提取率高于乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和水等溶劑，并且抗氧化能力強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同提取劑及料液比對沙棘葉的抗氧化活性也有顯著影響。有文獻(xiàn)報(bào)道，用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇4種不同溶劑對沙棘籽分別進(jìn)行8 h萃取,甲醇作為萃取劑的提取物具有最高的抗氧化活性[23]。有研究者采用不同濃度的丙酮、甲醇、酸化甲醇、乙酸乙酯對沙棘籽提取物抗氧化活性進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn)，70%丙酮提取物具有最強(qiáng)的還原力[24]，本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)丙酮作為提取劑，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，還原力達(dá)到最大值為0.85，該報(bào)道與本研究結(jié)果較為相似。

試驗(yàn)進(jìn)一步對不同提取物中活性物質(zhì)含量與抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)的含量與抗氧化性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。尤其是抗壞血酸、總多糖、總黃酮的含量與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)較高，由此證明抗壞血酸、多糖、黃酮化合物可能是沙棘葉抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。