拱健婷，李 莉，叢 悅，張金霞，王大仟，關佳莉，趙藝萌

（北京市臨床藥學研究所/北京市中藥研究所，北京 100035）

姜科植物溫郁金Curcuma wenyujinY. H. Chen et C.Ling 主產(chǎn)于浙江瑞安，為著名的“浙八味”之一。溫郁金源中藥的藥用歷史悠久，因其藥用部位、加工方式的不同，分為3種不同的中藥——溫郁金、溫莪術、片姜黃，稱為一株三藥[1]。以上3種中藥均廣泛應用于臨床湯劑、中成藥制劑中，塊根蒸至透心干燥稱為溫郁金，長于破血化瘀；側(cè)根莖鮮縱切厚片干燥稱為片姜黃，長于破血行氣；主根莖蒸熟干燥稱為溫莪術，長于行氣止痛[2-3]，因此溫郁金源中藥的準確鑒別對臨床精準用藥至關重要。

氣味鑒別在中藥的品質(zhì)分析中一直占有非常重要的地位。電子鼻和氣-質(zhì)聯(lián)用技術是目前氣味分析的重要研究手段。電子鼻通過對樣品氣味輪廓信息進行綜合分析，能快速、無損地反映樣品的整體氣味特征，目前已被廣泛應用于食品、環(huán)境監(jiān)測、藥品等領域[4-7]。氣-質(zhì)聯(lián)用技術則能夠?qū)崿F(xiàn)待測樣品具體揮發(fā)性成分的定性和定量分析，氣-質(zhì)聯(lián)用與電子鼻技術的結(jié)合能夠全面地分析、評價中藥的氣味特征。目前已有文獻對溫郁金源3種中藥溫郁金、溫莪術、片姜黃的揮發(fā)性成分進行分析[8-10]，但是溫郁金源中藥氣味電子鼻響應的物質(zhì)基礎研究尚無相關報道。本研究以溫郁金源3種中藥為研究對象，利用電子鼻對樣品氣味輪廓進行分析，以期為溫郁金源3種中藥的快速鑒別提供參考依據(jù)；為實現(xiàn)電子鼻分析結(jié)果的最大可能關聯(lián)，采用HS-GC-MS對中藥原粉氣味進行測定，為溫郁金源3種中藥氣味傳感器反應機制分析提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

α-FOX3000型電子鼻（法國阿默思公司）；Agilent 7890B-5977A型氣相色譜質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技公司）；TriPlus 300型頂空自動進樣器（美國賽默飛世爾科技公司）；MSD Chemstation D.03.00.611色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國安捷倫科技公司）；質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫：NIST MS search 2.0；BSA-124S型電子分析天平（德國賽多利斯集團）；BJ-150型粉碎機（德清拜杰電器有限公司）。

溫郁金源3種中藥樣品均購自浙江磐安浙八味市場，經(jīng)北京市臨床藥學研究所李莉研究員依據(jù)性狀特征鑒定為源于溫郁金Curcuma wenyujinY. H. Chen et C.Ling植物塊根及根莖的溫郁金、溫莪術、片姜黃。

1.2 方法

1.2.1 電子鼻檢測 精密稱取樣品粉末（65目）0.3 g裝入頂空進樣瓶，壓蓋密封。設定電子鼻檢測參數(shù)為孵化時間：600 s；孵化溫度：45 ℃；進樣量：1 500 μL；信號采集時間：90 s；采集周期：1 s；吹掃時間：600 s。各樣品平行測定5次，記錄樣品的氣味響應值曲線。

1.2.2 HS-GC-MS檢測 精密稱取樣品粉末0.6 g裝入20 mL頂空進樣瓶中，加蓋密封，放入自動進樣器樣品盤中。樣品瓶加熱溫度：90 ℃；樣品環(huán)溫度：110 ℃；傳輸線溫度：120 ℃；樣品瓶加熱時間：5 min；樣品環(huán)平衡時間：0.2 min；進樣時間：0.2 min。

色譜條件： Thermo TG-624色譜柱（60 m × 250 μm ×1.4 μm）；進樣口溫度為220 ℃；載氣為氦氣；柱流量為1 mL/min；分流比為5∶1；程序升溫條件：初始溫度為80℃，以8 ℃/min升至90 ℃，保持4 min，以6 ℃/min升到200 ℃，保持12 min。

質(zhì)譜條件： 電離方式為EI，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z為 40 ～ 450。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

利用Alpha Soft V11提取12根傳感器的最大響應值為特征值，采用SPSS 21.0進行方差分析，SIMCA-P 13.0進行PCA、PLS-DA分析，PLS相關性分析由Unscrambler X 10.4完成。根據(jù)NIST 14L譜庫檢索結(jié)果、匹配度及參考文獻對HS-GC-MS 檢測所得揮發(fā)性成分進行定性分析，采用峰面積歸一化法確定各組分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫郁金、溫莪術、片姜黃的氣味分析

2.1.1 雷達圖分析 溫郁金、溫莪術、片姜黃樣品電子鼻平均響應值的雷達圖，見圖1。經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示溫郁金、溫莪術、片姜黃在12根傳感器上的響應值不同（P＜0.01）。 傳感器陣列特征響應雷達圖的差異在一定程度上反映了樣品香氣的差別。

圖1 溫郁金、溫莪術、片姜黃電子鼻傳感器響應值雷達圖Fig.1 Radar map of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.1.2 主成分分析（PCA） 樣品氣味與電子鼻傳感器的聯(lián)系用電子鼻數(shù)據(jù)的PCA 雙標圖表示，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示PCA 主成分的累積貢獻量為99.88%，說明其保留了原始數(shù)據(jù)中大部分的信息量。在PCA 模型中，各個樣品分布在不同區(qū)域，表明溫郁金、溫莪術、片姜黃中揮發(fā)性成分氣味信息具有明顯差異，電子鼻能將其快速區(qū)分。同時可以看出傳感器LY2/Gh、LY2/gCT1及T型、P型傳感器（第二象限中傳感器從左至右依次為T70/2、T30/1、PA/2、P10/1、P40/1、P10/2）傾向于溫郁金，而傳感器LY2/G、LY2/AA傾向于溫莪術，LY2/LG和LY2/AA傾向于片姜黃。另外，Loading分析結(jié)果顯示，LY2/G、LY2/AA對第一主成分的貢獻率較大，LY2/Gh、LY2/gCT1對第二主成分的貢獻度較大。

圖2 溫郁金、溫莪術、片姜黃電子鼻數(shù)據(jù)主成分分析雙標圖Fig.2 Bioplot of PCA based on E-nose data of Curcuma Radix,Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.1.3 偏最小二乘判別分析（PLS-DA） 進一步將溫郁金、溫莪術、片姜黃的氣味信息分組，建立了PLS-DA模型。PLS-DA 是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法，能凸顯組間差異，利于分組[11]。采用前2個主成分t［1］和t［2］進行PLS-DA分析，獲得樣品分布散點圖和變量VIP 圖，見圖3、4。PLS-DA 結(jié)果中，主成分t［1］對總方差的貢獻率為71.9%，主成分t［2］對總方差的貢獻率為28.1%，R2X、R2Y和Q2分別為0.999、0.998、0.998，模型有意義，且片姜黃、溫莪術、溫郁金能夠得到有效區(qū)分。12根傳感器中LY2/gCT、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/LG對片姜黃、溫莪術、溫郁金氣味差異貢獻較大，為主要變量（VIP＞1），見圖4。上述結(jié)果表明，片姜黃、溫莪術、溫郁金氣味存在差異，電子鼻結(jié)合化學計量學方法能夠較好地區(qū)分溫郁金源3種中藥。

圖3 溫郁金、溫莪術、片姜黃3種中藥PLS-DA 分析的樣品分布散點圖Fig.3 Score scatter plot by PLS-DA of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

圖4 溫郁金、溫莪術、片姜黃3種中藥變量的重要性差異Fig.4 VIP plot by PLS-DA of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.2 HS-GC-MS測定結(jié)果分析

溫郁金、溫莪術、片姜黃樣品的總離子流圖，見圖5。通過化學工作站進行數(shù)據(jù)處理并利用峰面積歸一化法對溫郁金、溫莪術、片姜黃的總離子流圖中各組分的相對質(zhì)量分數(shù)進行計算，使用NIST 14 L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對各峰的質(zhì)譜圖進行檢索，確定各個組分。結(jié)果檢測到的揮發(fā)性成分共計48 種，分別從溫郁金、溫莪術、片姜黃中鑒定出了23、19、36種成分，三者共有成分12種，分別為α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、d-檸檬烯、對傘花烴、桉葉油醇、2-蒈烯、樟腦、δ-欖香烯、β-欖香烯與β-石竹烯，見表1。

表1 溫郁金、溫莪術、片姜黃中揮發(fā)性成分的HS-GC-MS分析結(jié)果Tab. 1 Identification of the main volatile components of Curcuma Radix,Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum by HS-GC-MS

圖5 溫郁金、溫莪術、片姜黃的HS-GC-MS總離子流圖Fig.5 HS-GC-MS total ion chromatogram of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

依據(jù)化合物結(jié)構分類并計算出各類物質(zhì)相對含量，如圖6所示，主要揮發(fā)性物質(zhì)分為烯烴類、酮類、酯類等。其中，溫郁金、溫莪術樣品中烯烴類物質(zhì)含量分別為61.96%、81.15%，在揮發(fā)性物質(zhì)中含量最高，片姜黃中也含有32.77%，某些烯烴類成分對樣品的氣味有重要作用[12]，這些物質(zhì)可能是構成溫郁金源3種中藥氣味的基礎。醇類物質(zhì)僅在片姜黃中檢測出，但一般認為醇類物質(zhì)的閾值較高[13]，對樣品的氣味貢獻不大。溫郁金中未檢測出酯類物質(zhì)，而酯類物質(zhì)是一類十分重要的呈香物質(zhì)，閾值低[14-15]，片姜黃、溫郁金、溫莪術酯類物質(zhì)含量差別較大，可能它們之間香氣有區(qū)別的重要原因。對于酮類化合物，片姜黃、溫莪術、溫郁金中分別檢測出6、3、1種，且在片姜黃中的含量最高?？梢酝茰y出片姜黃、溫郁金、溫莪術在氣味上存在較大差異。

圖6 片姜黃、溫莪術、溫郁金各類型揮發(fā)性物質(zhì)分析比較結(jié)果Fig.6 The comparison results of various types of volatile components analysis of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.3 電子鼻氣味與揮發(fā)性成分的相關性分析

為研究溫郁金源3種中藥產(chǎn)生氣味的具體化學成分與電子鼻傳感器的反應機制，將48種揮發(fā)性成分相對含量與電子鼻響應值作為研究對象，采用PLS法以化合物的相對含量為自變量，12個傳感器的響應值為因變量進行相關性分析，結(jié)果見圖7。大小橢圓分別表示50% 和100% 的方差解釋，因變量均在此范圍，說明可用PLS 模型很好地解釋其它變量。傳感器LY2/LG與LY2/AA分布在坐標圖的左側(cè)外圍，剩余10根傳感器均分布在坐標圖的右側(cè)外圍。傳感器與各化合物在圖上的距離越短，代表其相關性越高。傳感器LY2/G與C16（對傘花烴）緊密關聯(lián)，LY2/AA與C35（2-十一烷酮）、C41（莪術呋喃二烯酮）、C44（雙環(huán)大牻牛兒烯）相關性良好。在圖2中可知LY2/G、LY2/AA是區(qū)分片姜黃、溫莪術、溫郁金的重要傳感器，而C41（莪術呋喃二烯酮）、C44（雙環(huán)大牻牛兒烯）為溫莪術的特有成分，也是區(qū)別于片姜黃、溫郁金的重要揮發(fā)性成分。同樣，LY2/LG 與C2（α-側(cè)柏烯）C6（葑烯）等多種烯烴類成分及C28（側(cè)柏酮）、C34（左旋香芹酮）等酮類成分具有一定相關性；LY2/gCT與C47（γ-衣蘭油烯），P40/1與C8（L-檸檬烯）的相關性良好。由此推測部分烯烴類、酮類成分可引起傳感器LY2/G、LY2/AA、LY2/LG、LY2/gCT、P40/1的變化，從而達到區(qū)分片姜黃、溫莪術、溫郁金的目的。

圖7 揮發(fā)性成分與電子鼻傳感器相關性PLS分析圖Fig.7 PLS plot showing the correlation between volatile components and sensory evaluation

3 討論

本研究運用電子鼻和HS-GC-MS技術分別從整體香氣輪廓和具體香氣組分兩方面檢測溫郁金源3種中藥的氣味。電子鼻的PCA和PLS-DA模型能將片姜黃、溫莪術、溫郁金準確區(qū)分，表明其樣品間的氣味特征存在明顯差異，2020年版《中國藥典》對片姜黃、溫莪術、溫郁金的氣味描述分別為“氣香特異”“氣香或微香”“氣微香”，表明建立的氣味判別模型符合2020年版《中國藥典》中對溫郁金源3種中藥的氣味描述。根據(jù)傳感器的特性，提示片姜黃、溫莪術、溫郁金中刺激傳感器LY2/gCT、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/LG的揮發(fā)性成分對片姜黃、溫莪術、溫郁金氣味差異貢獻較大，可能為主要香氣物質(zhì)。利用HS-GC-MS對香氣成分作進一步研究，鑒別得到48種揮發(fā)性成分，并對其種類和相對質(zhì)量分數(shù)進行統(tǒng)計分析得出烯烴類、酮類成分是區(qū)分片姜黃、溫莪術、溫郁金的主要成分。HS-GC-MS 與電子鼻的PCA 結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

電子鼻技術可實現(xiàn)溫郁金源3種中藥的氣味信息客觀化，并結(jié)合化學計量學方法從整體氣味角度對片姜黃、溫莪術、溫郁金進行良好的識別，采用HSGC-MS 技術得到溫郁金源3種中藥的氣味電子鼻響應物質(zhì)基礎為烯烴類、酮類成分，為中藥產(chǎn)生氣味的物質(zhì)基礎與傳感器反應機制提供了進一步的實驗依據(jù)。