◎ 陳 喆

（福建省南平市食品藥品檢驗檢測中心，福建 南平 353000）

茶葉作為一種富含有機(jī)酸、鞣質(zhì)、色素、生物堿、多酚及嘌呤等復(fù)雜化學(xué)成分的植物原料，其多組分農(nóng)藥殘留測定問題一直是業(yè)界難點，前處理費時、耗力、耗材、費用高、基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)等特點成為行業(yè)多農(nóng)殘分析的熱點靶向基質(zhì)。一般通過QuEchERS方法（ACAS方法/歐盟方法）、快速濾過凈化管（m-PFC）[1]、傳統(tǒng)TPT或GCB/NH2小柱法[2]、溶劑萃取法、GPC[3]等各種前處理技術(shù)的使用，或是雙內(nèi)標(biāo)物法、保護(hù)劑雙柱串聯(lián)后反吹的儀器技術(shù)共同克服基質(zhì)效應(yīng)[4]。

本實驗中，茶葉里的待測農(nóng)藥殘留組分經(jīng)乙腈-乙酸混合溶劑提取，采用QuEchERS凈化方法，通過多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、內(nèi)標(biāo)法定量；優(yōu)化了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）的定量離子和定性離子，增加定性識別點個數(shù)，有效減少定性誤判；同時對茶葉基質(zhì)對多農(nóng)藥殘留基質(zhì)效應(yīng)情況進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

64種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物，購于Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、丙酮（色譜純）；冰乙酸、無水乙酸鈉（分析純）；無水硫酸鎂（分析純，用前在500 ℃馬弗爐內(nèi)烘5 h，冷卻后放入干燥器中備用）；PSA粉、C18粉、石墨化炭黑粉（GCB，購于島津公司）。

氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（TSQ8000 Evo，美國賽默飛世爾公司）；高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；IKA Tl8均質(zhì)器（德國IKA公司）；多功能全自動樣品濃縮儀（Biotage）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解并定容，配制成1 000 mg·L-1的63種單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液（內(nèi)環(huán)氧七氯）；移取適量農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至容量瓶中，用丙酮-正己烷（1∶1，V/V）稀釋并定容，配制成10 mg·L-1的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液；移取適量內(nèi)標(biāo)儲備溶液至容量瓶中，用丙酮-正己烷（1∶1，V/V）稀釋并定容，配制成10 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)儲備液；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液均貯存于（-18±1）℃冰箱中。

1.2.2 樣品處理

稱取2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置30 min。加入15 mL乙腈-醋酸溶液（99∶1，V/V）、6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min后在6 000 r·min-1離心5 min。吸取8 mL上清液加到內(nèi)含1 200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18及200 mg GCB的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min。6 000 r·min-1離心5 min，準(zhǔn)確吸取2 mL上清液于10 mL試管中，40 ℃水浴中氮氣吹至近干。加入20 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，加入1 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）復(fù)溶，過微孔濾膜，用于測定。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Pesticides II with 5 m guard石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國賽默飛公司）；柱溫：40 ℃；程序升溫過程：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃·min-1程序升溫至90 ℃，再以25 ℃·min-1升溫至90 ℃，保持1.5 min， 再 以 25 ℃·min-1， 升 溫 至 180 ℃； 再 以5 ℃·min-1升 溫 至 280 ℃， 再 保 持 1.5 min； 再 以10 ℃·min-1，升溫至300 ℃，保持5 min。載氣：氦氣，碰撞氣：氮氣，純度均≥99.999%，載氣流速1.2 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.3.2 質(zhì)譜條件

EI電壓：70 eV；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；數(shù)據(jù)采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；溶劑延遲：5 min，63種農(nóng)藥成分的保留時間及優(yōu)化的MRM參數(shù)見表1。

表1 63種農(nóng)藥成分的保留時間及優(yōu)化的MRM參數(shù)表

續(xù)表1

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍、線性方程

精確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級用丙酮-正己烷（1∶ 1，V/V）釋成質(zhì)量濃度為 5 μg·L-1、10 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1和 500 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?？瞻谆|(zhì)溶液氮氣吹干，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，分別加入1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶，過微孔濾膜配制成系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。以農(nóng)藥定量離子峰面積和內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積的比值為縱坐標(biāo)，農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在5.0～500.0 μg·L-1的濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)組分在茶葉基質(zhì)響應(yīng)值比率與含量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，具體結(jié)果見表2。

表2 茶葉-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程、相關(guān)系數(shù)表

2.2 回收率、精密度、檢出限

2.2.1 樣品加標(biāo)回收率和精密度

按1.2樣品處理和實驗條件，取茶葉樣品（綠茶、紅茶、烏龍茶），做3個濃度水平（分別為50 mg·kg-1、250 mg·kg-1、500 mg·kg-1）的標(biāo)準(zhǔn)加入回收實驗，稱取樣品后分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度添加水平均按本方法做6次平行測定，結(jié)果各農(nóng)殘目標(biāo)組分回收率為66.1%～126.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.7%～16.6%，詳見表3。

表3 茶葉樣品（加標(biāo)樣品）中64種農(nóng)藥殘留回收率、精密度表（n=6）

續(xù)表3

2.2.2 檢出限范圍情況

本次研究以綠茶作為茶葉基質(zhì)代表，以S/N=3計算檢出限（LOD）。從圖1可以看出，63種農(nóng)藥殘留目標(biāo)分析物中有52種檢出限低于0.01 mg·kg-1，其中檢出限低于0.001 mg·kg-1的有 14種，檢出限為 0.001～ 0.005 mg·kg-1的有17種，檢出限為0.005～0.01 mg·kg-1的有20種；檢出限為0.01～0.05 mg·kg-1的有10種，僅有2種目標(biāo)分析物檢出限大于0.05 mg·kg-1。

圖1 茶葉基質(zhì)中63種農(nóng)藥殘留目標(biāo)分析物的檢出限范圍圖

2.3 定性能力

按照歐盟方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[5]，質(zhì)譜方法定性確證必須達(dá)到最少4個識別點要求，定性點越多定性越準(zhǔn)確，反之則容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。對于低分辨質(zhì)譜，MRM監(jiān)測模式下，至少選擇2個離子對進(jìn)行定性確認(rèn)，一對離子計為2～2.5個定性點。若是1個母離子加上2個子離子則識別點為4，若是2個母離子，且每個有1個子離子則識別點為5。

因此本實驗中，選擇1個定量離子對和2個定性離子對，且有34種農(nóng)殘目標(biāo)物MRM選擇離子對的母離子都不同，按照計算可以得到農(nóng)藥殘留目標(biāo)物的識別點達(dá)到7.5個，極大地保證了定性的準(zhǔn)確性。對茶葉這一類基質(zhì)效應(yīng)影響較大、基質(zhì)干擾物（如氨基酸、色素、鞣制等）比較復(fù)雜的樣品，可以有效解決前處理也可能無法消除的定性誤判問題。

圖2（A）為250 mg·L-1硫丹標(biāo)準(zhǔn)溶液3個檢測離子的MRM色譜峰相對離子強(qiáng)度比較圖，圖2（B）為250 mg·L-1硫丹（茶葉基質(zhì)）溶液3個檢測離子MRM色譜峰相對離子強(qiáng)度比較圖。從圖2（A）可以看到離子對194.9→125的檢測離子125（b）與離子對194.9→159的檢測離子159（a）的相對離子強(qiáng)度比為80.41%，而圖2（B）可以看到離子對194.9→159的檢測離子159（a）有比較大的離子干擾，造成檢測離子159的色譜峰展寬拖尾嚴(yán)重，檢測離子125與檢測離子159的相對離子強(qiáng)度比為0.83%，不符合“檢測離子的相對離子強(qiáng)度比＞50%、相對離子強(qiáng)度應(yīng)在±20%”的要求，誤判為陰性；而舍去離子對194.9→159的檢測離子159（a），使用選擇離子對194.9→125的檢測離子125（b），選擇離子對240.6→205.9的檢測離子205.9（c），有兩個母離子且每個都有1個子離子，定性識別點有5個，仍可滿足定性確證必須達(dá)到確認(rèn)需要最少4個識別點要求，仍舊可將樣品判出陽性檢出。

圖2 硫丹3個檢測離子的MRM色譜峰相對離子強(qiáng)度比較圖

與常規(guī)方法比較，每個化合物多選擇一對定性離子對，當(dāng)另外一對定性離子對受到通過前處理也無法消除的基質(zhì)干擾時，仍舊不影響定性判定，在實際工作中靈活性強(qiáng)、便捷性高、應(yīng)用范圍更廣，克服基質(zhì)帶來的干擾更加有效。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)對比

色譜分析中，由于樣品基質(zhì)成分的存在，減少了色譜系統(tǒng)活性位點與目標(biāo)分子作用的機(jī)會，使得目標(biāo)分析物響應(yīng)比純?nèi)軇┲械纳V響應(yīng)高，出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)的效果。基質(zhì)效應(yīng)的相對強(qiáng)度（Matrix Effect，ME）=（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積比值/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積比值）×100%。將綠茶、紅茶、烏龍茶、蘋果和大米空白基質(zhì)按樣品方法進(jìn)行處理，氮氣吹干，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，分別加入1 mL上述50 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶，過微孔濾膜配制成各種基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，得到定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)溶液之比值，與純?nèi)軇?0 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液的對應(yīng)目標(biāo)物比值，按上述公式進(jìn)行計算，可得農(nóng)殘目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)的相對強(qiáng)度。

從圖3可知，同一目標(biāo)物在不同基質(zhì)中所受的基質(zhì)效應(yīng)的大小各有不同，其中茶葉與其他植物源基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)比較而言尤為不同。其他植物源基質(zhì)如蘋果對于有些農(nóng)藥殘留目標(biāo)分析物存在基質(zhì)效應(yīng)減弱的情況（ME小于100%），ME小于150%占到了1/3；而對于茶葉來說，不論綠茶、紅茶、烏龍茶都不存在目標(biāo)分析物基質(zhì)效應(yīng)減弱的情況，64種農(nóng)藥殘留分析基質(zhì)效應(yīng)影響超過600%占了1/2以上，而基質(zhì)效應(yīng)影響小于150%低于3%，說明茶葉基質(zhì)對農(nóng)藥殘留分析的影響更為復(fù)雜，目標(biāo)分析物基質(zhì)效應(yīng)呈現(xiàn)強(qiáng)增強(qiáng)效應(yīng)，必須使用基質(zhì)加標(biāo)曲線才能最大程度減小由于基質(zhì)效應(yīng)帶來的測定不準(zhǔn)確性。

圖3 不同基質(zhì)效應(yīng)比較圖

通過3種茶葉對相應(yīng)目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)的對比也可以發(fā)現(xiàn)，不同茶葉之間基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)的情況比較一致，定量分析時使用一種茶葉基質(zhì)作為基質(zhì)加標(biāo)曲線，即可有效克服基質(zhì)效應(yīng)，這也有利于日常開展茶葉農(nóng)藥殘留的分析，減少工作的煩瑣程度。

2.5 實際樣品檢測

用所建立的方法對市售的3種茶葉（紅茶、綠茶、烏龍茶）共30例樣品進(jìn)行測定，共有10批檢測出陽性目標(biāo)物，其中綠茶和紅茶樣品農(nóng)藥的檢出率較高，檢出頻率較高的農(nóng)藥為毒死蜱、氟蟲腈、硫丹、聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯，但均未超過最大殘留限量。

3 結(jié)論

本文建立了對茶葉中64種農(nóng)藥殘留進(jìn)行的QuEChERS-GC/MS/MS方法。該方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性好、操作簡便，適用茶葉類等復(fù)雜基質(zhì)的多種農(nóng)藥殘留的同時測定。優(yōu)化了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）的定量離子和定性離子，增加定性識別點個數(shù)，有效減少定性誤判和克服離子干擾，研究了茶葉基質(zhì)對多農(nóng)藥殘留基質(zhì)效應(yīng)情況，為茶葉多農(nóng)殘分析研究提供了可靠的檢驗方法。