喬 梁胡山崗李榮霞

(1.河南省中醫(yī)院急診科,鄭州 450002;2.青海省人民醫(yī)院急救中心,西寧 810007)

支氣管哮喘是主要是炎性反應(yīng)導(dǎo)致的累及肺組織和氣管的遷延不愈的慢性疾病。臨床上主要表現(xiàn)為胸悶、反復(fù)咳嗽、呼吸急促、喘息等癥狀,尚無根治性治療手段,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,甚至是危及患者生命的安全。近年來,該病的發(fā)病率隨工業(yè)化進(jìn)程導(dǎo)致的環(huán)境污染的加劇而逐年上升[1]。傳統(tǒng)的中醫(yī)藥技術(shù)在控制呼吸系統(tǒng)炎癥性反應(yīng)方面具有明顯的優(yōu)勢。支氣管哮喘在中醫(yī)上被稱為“哮”病。寒飲蘊(yùn)肺證癥是“哮”病中最為常見的臨床證候,機(jī)體陽氣不足,肺主行水功能失調(diào),水飲蘊(yùn)積與肺,使患者出現(xiàn)肺陽不足,宣降失常,痰阻氣滯,逐漸發(fā)展成寒飲滯留于肺[2]。

中醫(yī)師在長期的一線探索中,已經(jīng)證實(shí)[3]厚樸麻黃湯、小青龍湯等中藥方劑具有宣發(fā)肅降,溫補(bǔ)陽氣,蠲化凝痰等療效。中醫(yī)傳統(tǒng)名方--溫陽化飲方主要由麻黃、五味子、桂枝、干姜、甘草、生白芍等味中藥組成,是用來控制陽虛寒飲內(nèi)停證候的常用方法。顏培正等[4]研究證實(shí)溫陽化飲方能明顯改善“形寒飲冷”的哮喘病寒飲蘊(yùn)肺證大鼠的肺功能,降低模型大鼠的死亡率。但是未深入探討本藥方對(duì)疾病的作用機(jī)制。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)和p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)是真核生物體內(nèi)將胞外信號(hào)傳遞進(jìn)胞核內(nèi)的與炎癥性應(yīng)激密切相關(guān)的通路之一。研究表明ERK1/2和p38MAPK信號(hào)在細(xì)胞的炎癥性應(yīng)激中參與調(diào)控炎性因子的分泌與釋放,并且調(diào)節(jié)應(yīng)激中細(xì)胞的分化和凋亡[5]。已有大量的動(dòng)物研究表明ERK1/2和p38MAPK信號(hào)在變應(yīng)性鼻炎、鼻竇炎、支氣管哮喘以及慢性阻塞性肺等慢性呼吸系統(tǒng)疾病中表達(dá)異常[6]。本研究通過建立支氣管哮喘寒飲蘊(yùn)肺證大鼠模型,從炎性角度以及氣道組織結(jié)構(gòu)變化入手,基于ERK1/2和p38MAPK信號(hào),來探討溫陽化飲方對(duì)支氣管哮喘寒飲蘊(yùn)肺證的作用機(jī)制,為中醫(yī)藥傳統(tǒng)名方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠,8~10周齡,體重(180±20)g,共計(jì)60只,從河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采購[SCXK(豫)2017-0001],動(dòng)物飼養(yǎng)在河南天致藥業(yè)有限公司的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房內(nèi)[SYXK(豫)2020-0007];本研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在3R原則的指導(dǎo)下給與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷,本研究經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(IACUC 2020-068)。

1.2 主要試劑與儀器

溫陽化飲方(由我院主任醫(yī)師的處方,主要由麻黃、五味子、桂枝、干姜、甘草、生白芍、黃芪、人參各10 g,細(xì)辛5 g,黃芪25 g等組成,在我院的中藥房抓取,并由專業(yè)中藥師進(jìn)行常規(guī)煎煮)。雷帕霉素(西羅莫司膠囊,0.5 mg×20粒,華北制藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字:H20100079)。

卵清白蛋白(ovalbumin,OVA,每瓶25 g,美國Sigma公司,生產(chǎn)批號(hào):350741);p-ERK1/2(生產(chǎn)批號(hào):59042190)、p-p38 MAPK(生產(chǎn)批號(hào):59364925)抗體(美國abcam公司);兔抗大鼠磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)(生產(chǎn)批號(hào):TD90M-21)抗體(美國Thermo公司);TUNEL試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):45G6007)(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司);蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):YN-093M)(上海碧云天生物技術(shù)公司);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):BS-O934)(美國Amresco公司)。

OLYMPUS生物顯微鏡(生產(chǎn)批號(hào):6489M,Olympus公司,日本);-80℃深冷冰箱(生產(chǎn)批號(hào):4BG5-02,維根斯公司,德國);Leica RM2135組織切片機(jī)(生產(chǎn)批號(hào):V5679-0A,Leica公司,德國);高速低溫離心機(jī)(生產(chǎn)批號(hào):18-00 MH,北京六一儀器廠);微小動(dòng)物超聲霧化器(生產(chǎn)批號(hào):2XS73,Delong America公司,加拿大)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 支氣管哮喘寒飲蘊(yùn)肺證大鼠模型的構(gòu)建

(1)支氣管哮喘模型大鼠的造模步驟

大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為正常組、模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(n=15)。參照文獻(xiàn)[7]對(duì)大鼠先進(jìn)行致敏刺激,即在第1、8天腹腔注射1 mL的抗原液(主要有100 mg OVA、100 mg氫氧化鋁以及5×109個(gè)已經(jīng)滅活的百日咳桿菌疫苗組成),正常組大鼠腹腔注射等劑量的醫(yī)用生理鹽水;從第15天開始,造模大鼠在微小動(dòng)物超聲霧化器上進(jìn)行霧化激發(fā),即霧化液為:1% OVA,頻次為:每天一次,持續(xù)時(shí)長為:20 min,不間斷進(jìn)行8 d,正常組大鼠的霧化液為醫(yī)用生理鹽水,時(shí)長和頻次同上。

(2)中醫(yī)中大鼠寒飲蘊(yùn)肺證模型的造模步驟

除第1、8天外,每天需給大鼠施加“飲冷”刺激,即每天在8:00AM-8:00PM時(shí)間段中,給大鼠0℃的冰水混合物,隨后施加“形寒”刺激:將大鼠每天放置在預(yù)先設(shè)定0℃的冰箱中3 h,待大鼠機(jī)體恢復(fù)正常后,準(zhǔn)備25℃上下的水,讓大鼠在其中游泳,當(dāng)其精疲力竭,使鼻孔沒入水中時(shí),將其撈出;從第15天開始,各組大鼠每日經(jīng)霧化激發(fā)后,放置在預(yù)先設(shè)定0℃的冰箱中3 h,待大鼠機(jī)體恢復(fù)正常后,準(zhǔn)備25℃上下的水,讓大鼠在其中游泳15 min,維持8 d。正常組大鼠不用進(jìn)行“飲冷”、“形寒”刺激,期間所有大鼠以標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)[8]。

1.3.2 各組大鼠的藥物干預(yù)

本研究中大鼠的用藥劑量根據(jù)成人(60 kg)溫陽化飲方煎劑日用藥量進(jìn)行計(jì)算[9],得出實(shí)驗(yàn)組大鼠的溫陽化飲方的劑量約為30 mg/kg,本研究所用藥方煎劑經(jīng)本課題組專門醫(yī)師在醫(yī)院藥房統(tǒng)一煎煮,給大鼠進(jìn)行藥物處理前均在25℃恒溫水浴箱內(nèi)放置10 min。從造模開始第2天開始,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠以劑量為30 mg/kg的溫陽化飲方和雷帕霉素溶液(以醫(yī)用生理鹽水進(jìn)行溶解)進(jìn)行灌胃給藥,正常組和模型組以等劑量的醫(yī)用生理鹽水灌胃,連續(xù)灌胃22 d。

1.3.3 各組大鼠肺功能的測定

造模過程中觀察并記錄各組大鼠的日常狀態(tài)和習(xí)慣,主要包括體重、飲水量、飲食量、精神狀態(tài)、呼吸狀況、活動(dòng)量等。在進(jìn)行肺功能測試時(shí)大鼠禁食不禁水24 h,腹腔注射75 mg/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,小微動(dòng)物肺功能分析儀測定大鼠肺功能[10],呼吸比:15∶10,呼吸機(jī)參數(shù)為:每分鐘75次,記錄各組大鼠吸氣時(shí)的氣道阻力(Rinsp)、呼氣時(shí)的氣道阻力(Rexp)、肺胸通氣時(shí)的動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)。

1.3.4 各組大鼠的肺以及氣管組織的病理學(xué)改變

測試完畢后,留取5 mL血,處死大鼠,無菌剝離大鼠的肺以及氣管組織,經(jīng)液氮分封存后,放置在深冷冰箱中待測。取出各組0.5 cm×0.5 cm大小的肺以及氣管組織,采用10%的甲醛固定24 h切片,HE染色,光鏡下觀察病理改變。

1.3.5 電鏡觀察各組大鼠肺和氣管組織的超微結(jié)構(gòu)改變

取出各組0.5 cm×0.5 cm大小的肺以及氣管組織,分別制成0.3 cm×0.5 cm大小的超薄組織切片:2.5%戊二醛固定8 h,清洗3次后,梯度濃度乙醇脫水,置于-20℃冰箱中干燥過夜,透射電鏡下觀察各組大鼠的肺和氣管組織超微病理結(jié)構(gòu)改變。

1.3.6 TUNEL染色檢測各組大鼠肺組織中的細(xì)胞凋亡

取出各組0.5 cm×0.5 cm大小的肺組織,經(jīng)固定,冰凍切片,梯度乙醇浸洗,風(fēng)干后3%雙氧水-甲醇浸泡,清洗,依次采用0.1% TritonX-100,0.1%緩沖液浸泡,清洗后,加入TUNNEL反應(yīng)液,暗濕盒反應(yīng),漂洗,脫水,透明,封片,熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7 ELISA法檢測各組大鼠血清中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量

取出50%的各組大鼠的血清,冰上解凍,根據(jù)IL-6和TNF-α試劑盒要求,繪制目標(biāo)蛋白的的標(biāo)準(zhǔn)曲線后,進(jìn)行測定。

1.3.8 Western blot檢測各組大鼠肺組織中p-ERK1/2、p-p38MAPK、凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2的表達(dá)水平

從冰箱中取出10%大鼠肺組織,采用常規(guī)方法提取總蛋白,測定蛋白濃度后,準(zhǔn)確量取50 μg,電泳將蛋白分離,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉,以(1∶500)比例稀釋后,維持4℃過夜孵育,次日,加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1500),經(jīng)顯色,曝光、顯影、定影后,以GAPDH為內(nèi)參來表示蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0軟件,作圖工具采用Graphpad5.01,采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料,采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較,若差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則進(jìn)一步組間兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠的一般情況

正常組大鼠精神狀態(tài)良好,呼吸正常,活動(dòng)量較多,反應(yīng)機(jī)敏,皮毛濃密且富有光澤,進(jìn)食、飲水規(guī)律,形體健壯,口、鼻等器官內(nèi)無異常分泌物。模型組大鼠精神狀態(tài)不佳,進(jìn)食、飲水較少,喜靜懶動(dòng),好扎堆,反應(yīng)遲緩,皮毛粗糙,暗淡,脫落明顯,呼吸急促,伴有咳嗽,騷鼻等行為,口、鼻等部位,均出現(xiàn)較多的粘性分泌物,大便不成形,不規(guī)律,形體日趨消瘦。對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)較模型組明顯改善,飲食、飲水較為規(guī)律,呼吸較為平穩(wěn),偶有咳嗽,口、鼻的粘性分泌物明顯減少,皮毛稍見脫落,體重較模型組明顯增加。實(shí)驗(yàn)組大鼠的反應(yīng)較為靈敏,已經(jīng)無扎堆狀況,呼吸節(jié)律趨于均勻,大小便趨于正常,飲水、飲食量較模型組明顯增加,大鼠的體重增加明顯。

2.2 各組大鼠肺功能的比較

各組大鼠肺功能檢測結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠Rinsp和Rexp出現(xiàn)明顯升高,Cdyn出現(xiàn)明顯下降(均P<0.05),與模型組相比,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠Rinsp和Rexp出現(xiàn)明顯下降,Cdyn出現(xiàn)明顯升高(均P<0.05),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),見圖1。

2.3 各組大鼠肺組織的病理學(xué)損傷和超微結(jié)構(gòu)的改變

HE染色結(jié)果顯示,正常組大鼠肺組織細(xì)胞排列規(guī)整,肺泡大小均勻,結(jié)構(gòu)完整,未見炎性細(xì)胞浸潤;模型組大鼠肺組織肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞填充,肺泡壁增厚明顯,正常肺泡結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯減少,間質(zhì)充血明顯,周圍組織腫脹明顯;對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的肺組織病理損傷明顯緩解,偶見炎性細(xì)胞滲出,肺泡結(jié)構(gòu)趨于正常,見圖2。

電鏡下觀察各組大鼠的肺組織的超微結(jié)構(gòu)改變結(jié)果顯示,正常組大鼠肺組織內(nèi)肺泡數(shù)量豐富,間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的線粒體排列規(guī)整,嵴結(jié)構(gòu)完整,染色質(zhì)的狀態(tài)正常,核膜未見異常;模型組大鼠肺組織的線粒體數(shù)量明顯減少,嵴結(jié)構(gòu)排列紊亂,重疊、溶解明顯,核膜缺損明顯,染色質(zhì)固縮嚴(yán)重;對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織的線粒體的數(shù)量明顯有所回升,嵴結(jié)構(gòu)的數(shù)量較模型組明顯增加,嵴間腔明顯減小,排列趨于正常,見圖3。

2.4 各組大鼠氣管組織的病理學(xué)損傷和超微結(jié)構(gòu)的改變

HE染色結(jié)果顯示,正常組大鼠氣管組織結(jié)構(gòu)完整,纖毛排列整齊,長度均一,支氣管管腔通暢,平滑肌厚度均勻,未見異常;模型組大鼠氣管粘膜上皮細(xì)胞可見明顯的粘液物,支氣管管腔內(nèi)可見大量的炎性細(xì)胞填充,多處出現(xiàn)滲血點(diǎn),纖毛粘連嚴(yán)重;對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的氣管組織的炎性損傷明顯緩解,氣管粘膜上皮細(xì)胞的纖毛排列趨于規(guī)整,稍見出血點(diǎn)和滲出物,但氣管組織的病理損傷較模型組明顯減輕,見圖4。

電鏡下觀察各組大鼠的氣管組織的超微結(jié)構(gòu)改變結(jié)果顯示,正常組大鼠氣管組織粘膜上皮細(xì)胞內(nèi),線粒體結(jié)構(gòu)完整,嵴結(jié)構(gòu)清晰可辨,核質(zhì)界限清晰;模型組大鼠氣管組織粘膜上皮細(xì)胞腫脹明顯,線粒體失去正常結(jié)構(gòu),嵴結(jié)構(gòu)或變短,或缺損,或消失,核質(zhì)界限不明,染色質(zhì)固縮嚴(yán)重;對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠氣管組織的線粒體的數(shù)量明顯有所回升,嵴結(jié)構(gòu)趨于正常,核質(zhì)界限趨于分明,核仁較為明顯,見圖5。

2.5 TUNEL檢測各組大鼠肺組織細(xì)胞的凋亡

TUNEL結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠肺組織的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05),與模型組相比,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織的細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),見圖6。

Western blot結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠肺組織中Bcl-2的表達(dá)明顯下降,Bax的表達(dá)明顯升高(均P<0.05),與模型組相比,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中Bcl-2的表達(dá)明顯升高,Bax的表達(dá)明顯下降(均P<0.05),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),見圖7。

注:A:正常組;B:模型組;C:對(duì)照組;D:實(shí)驗(yàn)組。與正常組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。圖1 各組大鼠的肺功能Note.A,Normal group.B,Model group.C,Control group.D,Experimental group.Compared with the normal group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 1 Lung function of rats in each group

注:A:正常組;B:模型組;C:對(duì)照組;D:實(shí)驗(yàn)組。圖2 肺組織病理改變Note.A,Normal group.B,Model group.C,Control group.D,Experimental group.Figure 2 Pathological changes of lung tissue

注:A:正常組;B:模型組;C:對(duì)照組;D:實(shí)驗(yàn)組。圖3 肺組織超微結(jié)構(gòu)改變Note.A,Normal group.B,Model group.C,Control group.D,Experimental group.Figure 3 Ultrastructural changes in lung tissue

注:A:正常組;B:模型組;C:對(duì)照組;D:實(shí)驗(yàn)組。圖4 氣管組織病理改變Note.A,Normal group.B,Model group.C,Control group.D,Experimental group.Figure 4 Pathological changes of tracheal tissue

2.6 ELISA測定各組大鼠血清中IL-6和TNF-α的含量

ELISA結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組血清中IL-6和TNF-α的水平明顯升高(P<0.05),與模型組相比,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中IL-6和TNF-α的水平明顯下降(P<0.05),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),見圖8。

2.7 Western blot檢測肺組織中p-ERK1/2、p-p38 MAPK的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠肺組織中p-ERK1/2、p-p38 MAPK的表達(dá)明顯升高(P<0.05),與模型組相比,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中p-ERK1/2、p-p38 MAPK的表達(dá)明顯降低(P<0.05),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),見圖9。

3 討論

支氣管哮喘是一種異質(zhì)性的炎癥性慢性疾病,主要的病灶點(diǎn)位于氣道以及兩側(cè)肺葉。該病受季節(jié)變化影響,多在夜間或凌晨使患者出現(xiàn)氣促、胸悶、呼吸困難、反復(fù)咳嗽等癥狀,并且該病遷延不愈,容易反復(fù)發(fā)作,臨床上尚無立竿見影的治療手段,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[11]。目前該病的發(fā)病人群趨于低齡化,發(fā)病率呈不斷增長的趨勢,嚴(yán)重影響我國的社會(huì)公共衛(wèi)生事業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。雖然西醫(yī)西藥技術(shù)在哮喘全球防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma,GINA)的規(guī)范下有所突破,但是難以使全部患者從中受益[12]。因此積極探索新的治療方案在臨床上具有重要意義。

中醫(yī)大家張仲景在《傷寒論》以及《金匱要略》中明確將支氣管哮喘歸為“哮證”“喘證”的范疇。寒飲蘊(yùn)肺證在臨床上最為常見[13]。傳統(tǒng)的中醫(yī)理論認(rèn)為寒飲蘊(yùn)肺證由外感于寒,邪氣誘發(fā)臟腑尤其是肺功能失調(diào),痰飲內(nèi)伏與肺,痰積氣道,濁氣難以宣降所致。歷史上的中醫(yī)名家對(duì)該證的治療主要以在“宣肺平喘,溫化寒痰”的指導(dǎo)下,以攻邪為主,對(duì)患者施以祛痰利氣,扶正溫陽治療[14]。閆偉等[15]研究表達(dá)小青龍湯能明顯抑制氣道炎癥性反應(yīng),提高支氣管哮喘寒飲蘊(yùn)肺證大鼠的機(jī)體免疫能力。桂素梅等[16]臨床觀察表明小青龍湯能明顯緩解寒飲內(nèi)停證哮喘發(fā)作期患兒的臨床癥狀。本研究中采用的溫陽化飲方是在長期的臨床探索中的自擬方,本湯劑在傳統(tǒng)的小青龍湯的基礎(chǔ)上佐以人參、黃芪構(gòu)成。人參、黃芪具有溫補(bǔ)肺陽,調(diào)中益氣的功效,本藥方具有強(qiáng)化溫陽化飲的作用,本研究結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程的日常行為明顯比模型組有所改善,肺功能明顯恢復(fù),肺組織和氣管組織的病理損傷和超微結(jié)構(gòu)損傷明顯緩解,證實(shí)了藥物對(duì)疾病的治療作用。

注:A:正常組;B:模型組;C:對(duì)照組;D:實(shí)驗(yàn)組。與正常組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。圖6 TUNEL染色Note.A,Normal group.B,Model group.C,Control group.D,Experimental group.Compared with the normal group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05Figure 6 TUNEL staining

注:A:正常組;B:模型組;C:對(duì)照組;D:實(shí)驗(yàn)組。圖5 氣管組織超微結(jié)構(gòu)改變Note.A,Normal group.B,Model group.C,Control group.D,Experimental group.Figure 5 Ultrastructural changes of tracheal tissue

注:A:正常組;B:模型組;C:對(duì)照組;D:實(shí)驗(yàn)組。與正常組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。圖7 大鼠肺組織中Bcl-2、Bax的表達(dá)Note.A,Normal group.B,Model group.C,Control group.D,Experimental group.Compared with the normal group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 7 Expression of Bcl-2 and Bax in rat lung tissue

注:A:正常組;B:模型組;C:對(duì)照組;D:實(shí)驗(yàn)組。與正常組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。圖8 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α的含量Note.A,Normal group.B,Model group.C,Control group.D,Experimental group.Compared with the normal group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 8 Levels of IL-6 and TNF-α in serum of rats in each group

注:A:正常組;B:模型組;C:對(duì)照組;D:實(shí)驗(yàn)組。與正常組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。圖9 肺組織中p-ERK1/2、p-p38 MAPK的表達(dá)Note.A,Normal group.B,Model group.C,Control group.D,Experimental group.Compared with the normal group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 9 Expression of p-ERK1/2 and p-p38 MAPK in rat lung tissue

闡明藥物的作用位點(diǎn),不僅有利于揭示疾病的病理機(jī)制,并且能更為有力的推動(dòng)中藥的開發(fā)以及臨床應(yīng)用。研究顯示ERK1/2和p38MAPK信號(hào)在機(jī)體內(nèi)廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、炎性應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等生理病理過程[17]。研究表明上、下呼吸道以及肺組織等氣道組織在進(jìn)行炎癥性應(yīng)激時(shí),ERK1/2被激活發(fā)生磷酸化,將炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)放大轉(zhuǎn)錄入核,調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α等多種促炎因子基因的表達(dá)[18]。Meng等[19]研究證實(shí)在過敏性哮喘小鼠中,抑制ERK1/2信號(hào)的磷酸化,能明顯改善小鼠的氣道炎癥。研究證實(shí)在應(yīng)激條件下,磷酸化后的p38MAPK激活相關(guān)效應(yīng)因子的轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá),一方面推動(dòng)中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的募集,強(qiáng)化炎性因子的分泌與釋放;另一方面磷酸化后的p38MAPK是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡開關(guān)(Bcl-2、Bax)的重要因素[20]。趙嘉涵等[21]研究表明阻斷p38MAPK的激活,抑制p38MAPK的磷酸化,能明顯減輕大鼠在腸缺血再灌注中肺組織的病理損傷。Nie等[22]研究證實(shí)在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中,p38MAPK特異性抑制劑能明顯降低肺組織的細(xì)胞凋亡,緩解肺組織的病理損傷。本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中的細(xì)胞凋亡率以及血清中IL-6和TNFα的含量明顯降低,肺組織中ERK1/2、p38MAPK的磷酸化明顯受阻,推斷溫陽化飲方對(duì)支氣管哮喘大鼠寒飲蘊(yùn)肺證的干預(yù)作用通過ERK1/2和p38MAPK信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,在支氣管哮喘寒飲蘊(yùn)肺證大鼠模型中,溫陽化飲方能明顯抑制炎性因子的釋放,降低肺組織的細(xì)胞凋亡,這可能與抑制ERK1/2和p38MAPK信號(hào)有關(guān)。但是考慮到個(gè)人的體質(zhì)的辯證關(guān)系以及對(duì)藥物的敏感程度,臨床上應(yīng)用治療支氣管哮喘寒飲蘊(yùn)肺證時(shí)需要嚴(yán)格遵守醫(yī)師的醫(yī)囑,進(jìn)行抓藥或者煎煮。