周唯君彭 濤周棟珍楊懿琛周艷華李 化何志旭舒莉萍?

(1.貴州醫(yī)科大學細胞工程生物醫(yī)藥技術國家地方聯(lián)合工程實驗室,貴州省再生醫(yī)學重點實驗室,基礎醫(yī)學院免疫學教研室,貴陽 550004;2.中國醫(yī)學科學院成體干細胞轉化研究重點實驗室,貴陽 550004;3.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 兒科學教研室,貴州 遵義 563003;4.貴州大學,貴陽 550025)

核糖體蛋白(ribosomal proteins,RPs)廣泛存在于細胞中,參與RNA結合的過程,并在蛋白質的生物合成中發(fā)揮重要作用,同時還在細胞的增殖與凋亡、耐藥、發(fā)育、免疫等多個方面發(fā)揮作用[1-2]。RPs的功能障礙與如血液系統(tǒng)疾病、代謝性疾病與癌癥等的多種疾病密切相關[3]。核糖體蛋白L15(ribosomal protein L15,RPL15)是核糖體L15E蛋白家族的成員,RPL15主要定位于真核細胞的核仁內并且呈現(xiàn)點狀分布,位于60 S的核糖體大亞基上,對核仁的形成及核仁結構的維持有著重要的作用[4]。

隨著對RPL15的深入研究,RPL15表達水平的異常與多種疾病的發(fā)生或發(fā)展有著密切關聯(lián),在胃癌、食管癌、胰腺癌及結腸癌中均發(fā)現(xiàn)RPL15的異常表達[5-8]。在先天性紅系再生障礙性貧血(Diamond-Blackfan anemia,DBA)中也發(fā)現(xiàn)了一個由RPL15基因突變引起的DBA新亞型,由此確定了RPL15為一個新的DBA致病基因之一[9]。DBA是一種罕見的常染色體骨髓衰竭綜合征,也被認為是一種核糖體病,患病者具有核糖體蛋白基因突變。DBA的主要表現(xiàn)為:紅細胞再生障礙性貧血、皮膚和骨骼異常以及癌癥易發(fā),在臨床上,DBA一直缺乏有效的治療,主要是通過長期輸注紅細胞和使用激素沖擊療法來緩解病程的進展,唯一的治療方式為造血干細胞移植[10]。核糖體蛋白的表達受到影響將會進而影響細胞的存活[11]。然而對于核糖體蛋白在這些疾病中發(fā)揮作用的作用機制及分子機制不甚清楚。

斑馬魚作為與人類造血調控高度保守的模式生物,其擁有造血系統(tǒng)發(fā)育過程與人類相似、胚胎發(fā)育迅速、飼養(yǎng)成本相對低廉且易于觀察等優(yōu)勢。本研究旨在斑馬魚中找到人rpl15基因的同源物,分析其部分遺傳學特征,通過探究rpl15基因在胚胎中的表達形式,以期了解rpl15基因在造血發(fā)育過程中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗中采用0~3日齡的Tüebingen品系野生型斑馬魚的胚胎與幼魚,其中用于繁殖幼魚的成魚體重約為350~400 mg,雌雄各10尾,嚴格遵循使用實驗動物的3R原則,所用斑馬魚均為本實驗室自行繁育、培養(yǎng)[SYXK(黔)2018-0001]。所有研究方案均通過貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的審批(No.1603041)。

1.2 主要試劑與儀器

pCS2+載體由本實驗室保存;E.coliDH5α菌株、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;高保真KODPLUS PCR酶購自日本Toyobo公司;反轉錄試劑First Stand cDNA Synthesis Kit、限制性內切酶EcoRⅠ、NotⅠ、T4DNA連接酶、NE-PERTM細胞核和細胞質提取試劑盒、BCA蛋白質定量試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;DIG RNA Labeling Mix、蛋白酶K購自瑞士Roche公司;TRIzol試劑、NucAwayTMSpin Columns購自美國Ambion公司;T3聚合酶購自美國Promega公司;BCIP/NBT購自日本VectorLab公司;Rabbit Anti-RPL15抗體和Goat Anti-Rabbit IgG H & L(HRP)均購自英國Abcam公司;PVDF膜和ECL化學發(fā)光液均購自美國Millipore公司;PCR儀購于德國Eppendorf公司;分子雜交箱購于美國UVP公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚養(yǎng)殖方法

斑馬魚野生型Tüebingen品系養(yǎng)殖標準參照The Zebrafish book[12],養(yǎng)殖在本課題組28.5℃的14 h光照/10 h黑暗的循環(huán)水系統(tǒng)中[13]。按照雌雄1∶2或者1∶1的比例將性成熟(16~24周齡)的斑馬魚進行配對,并在中間用透明膠板隔開,在第2天光照刺激5~10 min后拔去膠板,約在1.5 h后收集斑馬魚胚胎,加入胚胎培養(yǎng)液eggwater(0.06 mg/mL海鹽、0.5 mg/L亞甲基藍)并置于28.5℃的培養(yǎng)箱中孵化,每天更換eggwater兩次并吸出死胚。

1.3.2 基于數(shù)據(jù)庫和軟件的斑馬魚rpl15基因生物信息學分析

在美國國家生物信息技術中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中分別查找出rpl15基因在人類、斑馬魚、小鼠染色體的位置,記錄匯總,并與Ensemble數(shù)據(jù)庫中的基因信息進行比對,進行共線性分析并繪圖。分別記錄人類、斑馬魚、小鼠和果蠅等物種的rpl15基因的蛋白序列,用DNAMAN進行多序列比對出蛋白質相似性,再利用MEGA X構建系統(tǒng)發(fā)生樹,采用Neighbor-joining算法并運行500次bootstarp對系統(tǒng)發(fā)生樹進行評估。

1.3.3 斑馬魚總RNA的提取及cDNA的合成

收集0.75~72 hpf(hourspost-fertilization,受精后小時)之間多個時相的斑馬魚胚胎置于離心管中(30枚/管),蛋白酶K脫卵膜,每管再加入1 mL TRIzol充分勻漿處理,經氯仿抽提兩次,然后異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌晾干后,加入適量DEPC水溶解。反轉錄按照First Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明書在PCR儀上操作,得到的cDNA置于-20℃凍存。

1.3.4 制備地高辛標記的rpl15基因的反義mRNA探針

根據(jù)GenBank中的rpl15基因序列(NM_001003447.1)設計引物(表1),引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。將用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后的pCS2+載體和用同樣兩種酶切處理的rpl15基因片段用T4DNA連接酶進行重組連接,測序鑒定重組質粒的序列并比對無誤后,將重組質粒pCS2+-rpl15經EcoRⅠ單酶切線性化,T3體外轉錄后經核酸純化柱純化,最后將得到的探針分裝并置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 斑馬魚rpl15基因PCR引物序列Table 1 Primers used for PCR of zebrafish rpl15 gene

1.3.5 斑馬魚全時相胚胎原位雜交

收集0.75~72 hpf之間的11個時相點的胚胎,每組35枚,脫膜用4% PFA固定,甲醇梯度脫水后置于-20℃凍存?zhèn)溆?。固定好的胚胎洗去多余甲?時相大于24 hpf的胚胎用蛋白酶K進行通透處理,先置于68℃雜交爐中預雜交1 h,再加入地高辛標記的rpl15反義mRNA探針雜交過夜。第2天依次用不同濃度的SSC緩沖液洗去多余的探針,加入稀釋5000倍的anti-DIG-AP于4℃反應過夜。第3天用MABT洗掉多余抗體,再加入新鮮配制的BCIP/NBT避光顯色,在體式顯微鏡下觀察到出現(xiàn)藍紫色雜交信號即終止染色,并用4% PFA固定后,將胚胎放在均勻涂抹甲基纖維素的玻璃皿上,在體視顯微鏡下拍照。

1.3.6 Western blot法檢測斑馬魚Rpl15蛋白表達水平

收集24、48、72 hpf胚胎,每組50枚,使用NEPERTM細胞核和細胞質提取試劑分別提取斑馬魚胚胎細胞質和細胞核的蛋白質,經BCA蛋白定量后上樣。變性的蛋白在SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離,然后濕轉至甲醇激活的PVDF膜上。再以5%的脫脂奶粉封閉1 h;1×TBST洗3次后,加入稀釋1000倍的Rabbit Anti-RPL15抗體于4℃孵育過夜;1×TBST洗3次后,加入稀釋2000倍的Goat Anti-Rabbit IgG H & L(HRP)室溫孵育2 h;1×TBST洗3次后,根據(jù)ECL檢測試劑盒的說明書配制曝光液,使用化學發(fā)光分析儀檢測,掃描圖像后,用ImageJ 8.0軟件分析目的蛋白與GAPDH的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有實驗均重復三次或三次以上,并用GraphPadPrism 8.0軟件中的單因素方差進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 不同物種間rpl15基因的生物信息學分析結果

對斑馬魚和人類的rpl15基因進行了同線性分析(synteny analysis),結果顯示,rpl15基因位于斑馬魚19號染色體上,其上、下游6個基因在內的基因組序列,在小鼠14號染色體及人類3號染色體短臂上能找到與其相對應的同源區(qū)(圖1)。利用DNAMAN軟件對比分析斑馬魚、人類和小鼠rpl15蛋白質的相似性,結果顯示,斑馬魚rpl15氨基酸序列與人氨基酸序列相似度為95%,與小鼠的相似度為74%。使用MEGA X繪制14個物種rpl15的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

圖1 rpl15基因的Synteny分析結果Figure 1 Synteny analysis of rpl15 gene among homo sapiens and zebrafish

圖2 rpl15基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Figure 2 Alignment of rpl15 in different organizations

2.2 pCS2+-rpl15重組質粒測序結果

將經氨芐抗性篩選的重組質粒用RT-PCR初步驗證,再將RT-PCR驗證結果為正確(圖3)的質粒進行測序,通過比對測序結果與rpl15的基因序列一致,未發(fā)生突變(圖4)。

圖3 pCS2+-rpl15重組質粒EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切產物電泳鑒定結果Note.M,DNA markⅢ.1,pCS2+.2,pCS2+-rpl15.3,rpl15 RT-PCR products.4,Blank control.Figure 3 Electrophoresis of double digested product of pCS2+-rpl15 recombinant plasmid by EcoRⅠand NotⅠ

圖4 pCS2+-rpl15重組質粒測序結果Figure 4 Gene sequencing analysis of pCS2+-rpl15 recombinant plasmid

2.3 rpl15基因在野生型斑馬魚胚胎發(fā)育早期的表達模式

在野生型斑馬魚胚胎發(fā)育過程中,在0.75~24 hpf均可見rpl15基因在組織中廣泛表達的陽性雜交信號;在24 hpf,rpl15基因在斑馬魚的幾乎所有細胞中廣泛表達,在眼睛的表達最強;到48 hpf,rpl15在中樞神經系統(tǒng)、咽弓和肝腸中表達最強,在胰腺中的表達也開始顯現(xiàn);72 hpf仍然可見rpl15在后腦中的表達以及胰腺、肝和腸道中的表達(圖5)。

圖5 原位雜交技術檢測rpl15基因在野生型斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達情況Figure 5 In situ hybridization of rpl15 gene

2.4 不同時相斑馬魚胚胎中Rpl15蛋白表達情況

Western blot結果顯示,24 hpf時幾乎觀察不到Rpl15蛋白質的表達,在24、48、72 hpf,隨著時間的增加,Rpl15蛋白質的相對表達量逐漸增多(圖6)。

注:A:不同時相胚胎中Rpl15蛋白電泳圖;B:不同時相胚胎中Rpl15蛋白表達水平(相對灰度值)。與24 hpf相比,?P<0.05,??P<0.01。圖6 野生型斑馬魚胚胎不同時相的Rpl15蛋白水平的表達情況Note.A,Electrophoresis of Rpl15 protein in embryos in different phases.B,Expression levels of Rpl15 protein in embryos in different phases(relative gray values).Compared with 24 hpf,?P<0.05,??P<0.01.Figure 6 Rpl15 protein expression in zebrafish embryos at different time points

3 討論

異常的核糖體生物合成導致的核仁增大是在100多年前的癌細胞中首次觀察到的,RP基因的種系突變引起了與癌癥相關的核糖體病DBA,DBA是第一個被發(fā)現(xiàn)和研究最廣泛的核糖體疾病,DBA分子發(fā)病機制的第一個重大突破來自發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S19基因的突變[2-4]。隨后又在DBA中發(fā)現(xiàn)了包括RPL15在內的其他20余個核糖體蛋白(RP)基因的突變[14]。雖然在過去的二十年中已經進行了廣泛的研究,但由于患者樣本的可獲得性有限,缺乏合適的動物模型,攜帶致病RP基因純合突變的敲除小鼠在發(fā)育早期死亡,如RPL5-/-、RPS19-/-的小鼠出現(xiàn)胚胎期致死,雜合突變體沒有表現(xiàn)出異常癥狀[15]等原因,對DBA的發(fā)病機制仍然知之甚少,臨床上也沒有有效的治療方法。在腫瘤樣本中已證實有一些的RP的表達增加,但其意義尚不清楚。如在胃癌、食管癌、結腸癌中均發(fā)現(xiàn)RPL15的高表達[5-8]。在乳腺癌患者體內全基因組激活篩選促進遠處轉移的基因研究中發(fā)現(xiàn),RPL15的高表達增加了多個器官的轉移性生長,并選擇性增強了其他核糖體蛋白的翻譯[16]。在本研究中,斑馬魚Rpl15蛋白和人類的RPL15蛋白的相似度高,提示rpl15基因與人類高度相似及在進化過程中是相對保守的,利用斑馬魚來建立rpl15缺乏的模型是可行的,為深入研究RPL15的功能奠定實驗基礎。

斑馬魚(Danio rerio)是一種小型淡水魚,最初起源于印度,是可用于研究人類疾病的脊椎動物發(fā)育生物學模式生物中的一種新的有效模式生物[17-19]。與小鼠模型相比,用斑馬魚作為DBA模型具有許多優(yōu)勢,包括胚胎發(fā)育快、胚胎透明,個體小易養(yǎng)殖,且在斑馬魚進化過程中,造血調控的基因高度保守,可用于研究造血發(fā)育系統(tǒng)。此外,斑馬魚的研究中還有一些疾病建模技術,如使用嗎啉代反義寡核苷酸(morpholino,MO)敲低靶基因的表達或使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除目標基因來建立疾病模型[20]。本研究采用全胚胎原位雜交及免疫印跡試驗分析在野生型斑馬魚胚胎發(fā)育過程中不同時期的組織中mRNA和蛋白水平的表達情況,有助于了解斑馬魚胚胎發(fā)育過程中該基因的表達情況。

本實驗中制備了地高辛標記的rpl15基因反義mRNA探針,通過全胚胎原位雜交了解到rpl15作為核糖體蛋白,主要表達在包括肝、胰腺、腸道等內胚層組織,且在胚胎發(fā)育的過程中的腦部、眼睛、體節(jié)等組織中也觀察到其表達。rpl15的表達在斑馬魚胚胎發(fā)育的不同階段均有發(fā)現(xiàn),這提示rpl15基因在斑馬魚胚胎發(fā)育的過程中起著重要的作用。

脊椎動物的造血發(fā)育是一個復雜的、多因素協(xié)調的過程[21]。24 hpf是斑馬魚原始造血的關鍵時期,此時斑馬魚的心臟開始跳動[22]。斑馬魚不同發(fā)育階段的Rpl15的蛋白結果表明,24 hpf斑馬魚胚胎中幾乎觀察不到Rpl15蛋白水平的表達。提示在早期發(fā)育過程中Rpl15可能在24 hpf后的斑馬魚胚胎中開始發(fā)揮作用,其表達量在胚胎發(fā)育過程中隨著時間的增加而增多。為本課題組使用MO或CRISPR/Cas9技術建立下調rpl15基因表達的模型提供了實驗基礎。

綜上所述,本研究首先利用生物信息學確定了在斑馬魚的rpl15的高度保守性及利用斑馬魚建立rpl15基因相關的疾病模型是可行的;其次,全胚胎原位雜交技術證實,rpl15基因在野生型斑馬魚胚胎發(fā)育過程中廣泛表達,幾乎所有組織中均能檢測到rpl15的表達,尤其是在發(fā)育中的胰腺、肝和腸道中,rpl15可能對斑馬魚胚胎的發(fā)育至關重要;最后通過免疫印跡證實Rpl15在24 hpf的胚胎中幾乎沒有表達,表明Rpl15蛋白表達開始于原始造血的關鍵期之后。本研究提示,可以利用斑馬魚建立以rpl15為靶點的疾病模型,為建立rpl15缺乏的疾病模型建立了實驗基礎。