金 巖，楊鎮(zhèn)嘉

（赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，赤峰 024001）

非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）為呼吸系統(tǒng)最常見的癌癥，近年來，其發(fā)病率及死亡率呈逐年升高趨勢［1-2］。目前臨床常用的治療方式有手術(shù)切除、放化療等，但研究指出，患者經(jīng)過治療后復(fù)發(fā)率仍較高，術(shù)后5年生存率較差［3-4］。因此急需尋找合適的治療方式，近來，靶向治療藥物的發(fā)展逐漸引起臨床研究人員的注意，其對腫瘤細胞具有針對性殺傷作用，而不良作用反應(yīng)較少［5］。Crizotinib是一種激酶抑制劑，其同類藥物如吉非替尼、奧西替尼等在治療NSCLC方面展現(xiàn)出較好的作用，但目前國內(nèi)尚未對其報道［6］。因此本實驗從生存分析角度出發(fā)，開展實驗，觀察Crizotinib對轉(zhuǎn)移性非小細胞大鼠生存時間的影響，并以大鼠血清肝細胞生長因子水平、腫瘤體積情況來評估轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌大鼠的生命質(zhì)量，為Crizotinib的抗腫瘤研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物60只荷瘤BALB/c裸鼠由廣東省職業(yè)衛(wèi)生檢測中心（動物許可證號：SYXK（粵）2014-0048）提供，周齡4～6周，體重160～180g。將裸鼠飼養(yǎng)在溫度21～25℃，濕度45～55%的空調(diào)房內(nèi)，保持12小時晝夜節(jié)律，并保持提供充足的水和食物。

1.1.2 主要試劑及主要儀器非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549細胞（上海華瑞生物科技有限公司），Crizotinib（蘇州恒球科技有限公司，CAS號：877399-52-5）；HGF試劑盒（南京信帆生物技術(shù)有限公司）；游標(biāo)卡尺（德清盛泰芯電子科技有限公司），低溫高速離心機（Hermel）等

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組［4］60只荷瘤BALB/c裸鼠隨機分為以下3組（每組20只裸鼠）：A組：非小細胞肺癌模型組，B組：生理鹽水對照組，C組：Crizotinib治療組，飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，消毒裸鼠右腋下皮膚后，皮下接種提前準(zhǔn)備好的A549肺癌細胞溶液0.2mL（細胞溶液濃度2×107個/mL），密切觀察肺癌腫瘤細胞生長情況每隔3天測量各組裸鼠腫瘤最大長徑、短徑，估算腫瘤體積，約2周后，當(dāng)大部分腫瘤體積在0.5～0.8cm3范圍并肉眼可見時，即為造模成功［4］，即可開始予以藥物灌胃治療，C組予以Crizotinib60mg/（kg·d）灌胃處理、B組予以同體積生理鹽水灌胃，注意每周重新稱量老鼠體重，調(diào)整藥物灌胃劑量。

1.2.2 裸鼠腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)檢查切取裸鼠的腫瘤標(biāo)本，10%的福爾馬林中浸泡固定，常規(guī)的脫水、石蠟包埋、切片、烤片、水化、透明、HE染色并在光鏡下觀察。

1.2.3 觀察各組裸鼠腫瘤生長情況在造模成功并開始灌胃給藥后，測量治療后第0天、第3天、第9天、第12天、第15天、第18天、第21天、第24天、第27天、第30天各組裸鼠腫瘤最大長徑、短徑，估算腫瘤體積，瘤塊體積=（長徑×短徑2）/2，并繪制腫瘤體積增長率曲線。

1.2.4 各組血清肝細胞再生因子含量測定消毒裸鼠右側(cè)腹股溝處皮膚，抽取右側(cè)股動脈血液2～3mL，將血液樣本標(biāo)記后靜置2 h，2000r/min離心10分鐘后，取上清液，置于－20℃待用。血清HGF含量采用ELISA法測定，操作步驟嚴(yán)格遵循測試盒說明書。

1.2.5 各組8周生存率計算每天密切觀察各組裸鼠死亡情況，記錄存活天數(shù)，觀察8周后，各組裸鼠存活只數(shù)計算各組8周生存率，并繪制生存曲線圖。8周生存率=各組第8周時存活只數(shù)/各組總只數(shù)×100%。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用 SPSS 17. 0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)用mean±SD表示，多組間差異的顯著性分析采用單因素方差分，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，各組生存率計算用Kaplan-Meier法。

2 結(jié)果

2.1 觀察記錄各組腫瘤生長情況觀察8周后，裸鼠處死，腫瘤組織部位取材，HE染色，觀察結(jié)果顯示，A組裸鼠腫瘤呈大面積浸潤狀態(tài)，壞死面積明顯增加，B組大鼠腫瘤組織浸潤同樣明顯，可見大量點狀物，C組腫瘤組織可見浸潤明顯減少，組織染色點狀物減少。每隔3天測量各組裸鼠腫瘤最大直徑，估算腫瘤體積，連續(xù)測量1個月。根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)做出3組腫瘤生長曲線圖（圖2），根據(jù)生長曲線圖可看出治療前期，3組腫瘤體積差異并不明顯，隨病情發(fā)展，各組裸鼠瘤塊均有不同程度增長。其中，A組、B組裸鼠瘤塊增長速度較快，C組瘤塊增長速度最慢。Crizotinib可抑制腫瘤生長，效果明顯。至治療后第9天開始，C組腫瘤平均體積可達到（0.40±0.02）cm3顯著小于B組腫瘤平均體積（0.52±0.02）cm3（t=18.973，P＜0.01）及A組腫瘤平均體積（0.50±0.0）cm3（t=12.403，P＜0.01）。治療后第12天、第15天、第18天、第21天、第24天、第27天、第30天C組腫瘤平均體積均顯著小于B組腫瘤平均體積及A組腫瘤平均體積（P＜0.01），見圖2、表1。

圖1 各組裸鼠腫瘤HE染色結(jié)果

表1 第23天、第28天腫瘤三組生長體積比較

圖2 腫瘤體積增長率曲線

2.2 比較三組血清HGF結(jié)果治療前A組、B組、C組三組血清肝細胞生長因子（HGF）分別為（1.35±0.12）ng/mL、（1.29±0.13）ng/mL、（1.33±0.09）ng/mL，各組無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=2.5816，P＞0.05）。治療1周后A組、B組、C組三組血清人肝細胞生長因子（HGF）分別為（2.53±0.23）ng/mL、（2.42±0.34）ng/mL、（0.92±0.02）ng/mL，C組HGF水平較A組、B組顯著降低（tA=31.187，P＜0.01），（tB=19.696，P＜0.01）。治療2周后 A組、B組、C組三組血清人肝細胞生長因子（HGF）分別為（2.61±0.21）ng/mL、（2.55±0.19）ng/mL、（0.88±0.01）ng/mL，C組HGF水平較A組、B組顯著降低（tA=36.800，P＜0.01），（tB=39.253，P＜0.01）。詳見圖3。

圖3 各組裸鼠HGF評分比較結(jié)果各組裸鼠HGF評分比較，A組：非小細胞肺癌模型組，B組：生理鹽水對照組，C組：Crizotinib治療組，**P＜0.01

2.3 各組裸鼠8周生存率比較研究結(jié)果顯示：A組、B組裸鼠最早出現(xiàn)死亡，與A組、B組相比，C組裸鼠生存時間明顯得到延長（P＜0.05），且C組裸鼠8周生存率55%顯著高于A組10%、B組15%，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由以上數(shù)據(jù)可知，Crizotinib可有效延長非小細胞肺癌裸鼠生存時間。

圖4 各組裸鼠8周生存曲線

3 討論

流行病學(xué)統(tǒng)計顯示截止2000年，肺癌在全世界發(fā)病率位列榜首，死亡率占所有腫瘤致死率的1/3［7］。近年來隨著生活環(huán)境的不斷惡化和人們生活壓力的增加，各種癌癥的發(fā)病率不斷攀升，肺癌的發(fā)病率、致死率也在全國范圍內(nèi)急劇增長［8］。有研究表明，若肺癌的誘因得不到有效控制，至2025年，我國會以每年增加100萬初發(fā)肺癌的速度，成為全球范圍內(nèi)的肺癌大國［9］。流行病學(xué)統(tǒng)計顯示截止2000年，肺癌在全世界發(fā)病率位列榜首，死亡率占所有腫瘤致死率的1/3［10］。非小細胞肺癌（NSCLC）是臨床肺癌的主要病理類型，占肺癌總病理類型的75%～80%［11-12］。但是目前尚無有效治療藥物，患者預(yù)后極差，發(fā)病后存活時間短。Crizotinib是一種激酶抑制劑，其可用于間變性淋巴瘤激酶重新排列的非小細胞肺癌治療［13］?？死镞虻倌嵊?011年通過了美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的審批，用于非小細胞肺癌的治療。本實驗從生存分析角度出發(fā)，開展實驗，觀察克里唑蒂尼對轉(zhuǎn)移性非小細胞裸鼠生存時間的影響，并以裸鼠血清肝細胞生長因子水平、腫瘤體積情況來評估轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌裸鼠的生命質(zhì)量，為Crizotinib的抗腫瘤研究提供參考依據(jù)。

HGF是一種特殊的二聚體蛋白，其可促進多種類型細胞，如上皮細胞、癌細胞等分裂增加、活動增強、基質(zhì)侵襲［14］。肝細胞生長因子可與一種原癌基因調(diào)控的大分子跨膜蛋白結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，這種蛋白在體內(nèi)含量的變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。研究表明多種癌癥如肺癌、乳腺癌等患者體內(nèi)血清肝細胞生長因子水平顯著升高，且其變化水平與癌癥轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)［15］。本研究顯示治療后 C組HGF水平較A組、B組顯著降低，提示Crizotinib可有效降低體內(nèi)肝細胞生長因子含量。進一步研究結(jié)果顯示，C組大鼠治療后腫瘤增長速度明顯減慢，表明，Crizotinib對大鼠腫瘤增長有抑制作用，可能與Crizotinib能夠降低HGF進而減少腫瘤細胞的分裂有關(guān)。觀察大鼠生存情況發(fā)現(xiàn)，Crizotinib治療組大鼠的生存時間明顯延長，表明Crizotinib能夠減緩腫瘤的發(fā)展，降低腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移，提高大鼠的生存質(zhì)量。

綜上所述，Crizotinib可有效抑制非小細胞肺癌生長，降低血清肝細胞生長因子表達水平，提高裸鼠8周生存率，本課題組下一步將增加觀察時間，分析Crizotinib治療后大鼠的長期生存情況，并對其作用估計值進行更進一步探討，完善本研究。