李 峰，劉翠中，伍 媛

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，長沙 410005）

骨是由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞動態(tài)調(diào)節(jié)的器官，它們在骨轉(zhuǎn)換中起著重要的調(diào)節(jié)作用［1］。成骨細(xì)胞的主要功能是骨形成，而破骨細(xì)胞的主要功能是骨吸收［2］。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能失衡導(dǎo)致多種骨代謝疾病，包括骨質(zhì)疏松癥［3］。骨質(zhì)疏松通常伴隨著成骨細(xì)胞的增殖分化功能下降，骨質(zhì)流失等。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨形成在骨轉(zhuǎn)換中起著至關(guān)重要的作用［4］。在骨重建過程中，一系列骨轉(zhuǎn)換的標(biāo)志物被釋放出來［5］。越來越多的研究表明，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖是治療骨疾病的重要策略。因此，揭示成骨細(xì)胞對增殖、凋亡和分化的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。長非編碼rna（long non-codingrnas，lncRNAs）是一種長度超過200個核苷酸的非編碼rna（ncRNAs）。大量研究表明，lncRNAs在許多疾病中異常表達(dá)。它們能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和分化等關(guān)鍵過程，被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎的新生物學(xué)標(biāo)志物［6］。LNNA可能參與了成骨細(xì)胞的生長過程。然而，lncrna H19在成骨細(xì)胞表達(dá)變化的臨床意義卻鮮有報道。

miR-185-5p屬于非編碼的RNA分子，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。先前的研究表明miR-185-5p受H19調(diào)控影響MC3T3-E1成骨細(xì)胞的分化。然而，miR-185-5p在成骨分化細(xì)胞中增殖的潛在調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本文進(jìn)一步探討了lncRNA H19通過影響miR-185-5p表達(dá)對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)研究用小鼠MC3T3-E1細(xì)胞購自上海創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司（中國上海）。所有細(xì)胞在在5%的增濕空氣中，以α-最小必需培養(yǎng)基（α-MEM；美國Invitrogen），1%青霉素（100 U/mL，Gibco），鏈霉素（100μg/mL鏈霉素，Gibco）在37°C和5%CO2條件下培養(yǎng)。然后，誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞分化。對于miR-185-5P的表達(dá)抑制：miR-185-5p inhibitor（anti-miR-185-5p）和陰性對照（miRNC和anti-miR-NC）購自Ribobio（中國廣州）。用脂質(zhì)體3000（Invitrogen）導(dǎo)入MC3T3-E1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時，收集MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2 增殖活性檢測用CCK-8試劑（DOJINDO，Kumamoto，Japan）觀察細(xì)胞增殖活性。用特殊質(zhì)粒或寡核苷酸處理的MC3T3-E1細(xì)胞在96孔板上培養(yǎng)，然后繼續(xù)培養(yǎng)24h。每個孔加入10μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。通過在微型板分光光度計（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）檢測每個孔450 nm波長下的光密度，記錄MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性。

1.3 western-blot法分離的蛋白質(zhì)被印跡在膜上（聚偏二氟乙烯；美國馬薩諸塞州貝德福德的milipore）。然后，在封閉1h后，用獨特的一級抗體在4℃下孵育過夜。第二天，用相應(yīng)的次級抗體與一級抗體結(jié)合，并結(jié)合信號通過添加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（milipore）的試劑出現(xiàn)?？乖鲋诚嚓P(guān)抗原（PCNA，ab92552，1：1000，Abcam），ki67（OCN，1：1000，Abcam），GAPDH（ab9485，1：2500，Abcam）和山羊抗兔二級抗體（ab205718，1：5000，Abcam）用于本研究。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-PCR）MC3T3-E1細(xì)胞的總RNA通過TRIzol試劑（Invitrogen，USA）提取。用引物腳本一步法RT-PCR試劑盒（Takara，Japan）或miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（GeneCopoeia，Guangzhou）合成LncRNA-H19或miR-185-5p的第一鏈互補(bǔ)DNA，用SYBR預(yù)混合二聚體清除試劑盒（Takara）檢測LncRNA-H19、miR-185-5p的水平。用2-ΔΔCt法計算miR-185-5p和RNA-H19的表達(dá)水平，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)部對照。

1.5 雙熒光素酶報告分析用starbasev3.0預(yù)測了miR-185-5p與H19的3' 非翻譯區(qū)（UTR）的相互作用（http：//starbase.sysu.edu.cn/），合成了包含miR-185-5p潛在結(jié)合位點的H19序列片段，并將其嵌入載體中（美國威斯康星州麥迪遜市普羅梅加），分別命名為wt-H19與mut-H19。隨后，將MC3T3-E1細(xì)胞與miR-185-5p或miR-NC與lipofectamine3000（Invitrogen）共同轉(zhuǎn)染并在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48h后，按照說明書的指示，用雙熒光素酶報告試劑盒（Promega）分析熒光素酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析每項實驗至少重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SD表示。運(yùn)用SPSS 22.0軟件，對每次試驗三個獨立的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析（α=0.05）。兩組間差異性分析采用t檢驗。3組及以上組間差異分析采用單因素方差分析（ANOVA），2組間差異性比較采用Student’st檢驗.。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾H19對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響對MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染shRNA，沉默H19的表達(dá)，將MC3T3-E1細(xì)胞分為sh-NC組與sh-H19組。qRT-PCR檢測分析H-19的相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對照組相比，sh-H19組H19的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖1）。ccK8檢測細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示：與對照組相比，sh-H19組MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）（圖1）。細(xì)胞內(nèi)ki67蛋白反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況，westerton-blot檢測，結(jié)果顯示：與對照組相比，sh-H19組ki67表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）（圖1，C-D）。

圖1 沉默LncRNA H19降低MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性和ki67蛋白表達(dá)

2.2 干擾H19對AKT磷酸化的影響成骨細(xì)胞增殖受AKT磷酸化調(diào)控，為了探討MC3T3-E1細(xì)胞中LncRNA H19對AKT磷酸化表達(dá)的影響，western blot檢測結(jié)果顯示：sh-H19組P-AKT表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）（圖2，A-B）。

圖2 Western blot檢測sh-H19對P-AKT的表達(dá)的影響

2.3 LncRNA H19對MC3T3-E1細(xì)胞中miR-185-5p表達(dá)的影響為了探討MC3T3-E1細(xì)胞中LncRNA H19對miR-185-5p的表達(dá)的影響，運(yùn)用生物學(xué)技術(shù)對LncRNA H19對miR-185-5p的序列進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測顯示：LncRNA H19與miR-185-5p序列雖然存在高度差異，但是二者之間也存在序列互補(bǔ)性，即二者之間可能存在一定的靶向關(guān)系（圖3，A）。沉默MC3T3-E1細(xì)胞中H19表達(dá)，qRT-PCR檢測分析顯示：MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)sh-H19組miR-185-5p的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），即LncRNA H19對miR-185-5p的表達(dá)呈負(fù)調(diào)控（圖3，B）。進(jìn)一步驗證二者之間的相互作用，熒光素酶報告試驗顯示：野生型H19結(jié)合miR-185-5p組的熒光活性顯著低于H 19突變型結(jié)合miR-185-5p組（P＜0.05）（圖3，C）。

圖3 qRT-PCR檢測LncRNA H19對miR-185-5p表達(dá)的影響

2.4 sh-H19 轉(zhuǎn)染與miR-185-5p過表達(dá)對MC3T3-E1細(xì)胞中P-AKT表達(dá)的影響瞬時轉(zhuǎn)染sh-RNA及添加miR-185-5p抑制劑后，western blot檢測結(jié)果表明：miR-185-5p抑制劑組與miR-185-5p抑制劑+vector組的P-AKT表達(dá)水平跟對照組相比顯著增高（P＜0.05），miR-185-5p抑制劑+ sh-H19組的P-AKT表達(dá)水平跟對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 Western blot檢測sh H19及miR-185-5p抑制劑對P-AKT表達(dá)的影響

2.5 sh-H19 轉(zhuǎn)染及添加miR-185-5p抑制劑對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響瞬時轉(zhuǎn)染sh-RNA及添加miR-185-5p抑制劑后，qRT-PCR檢測結(jié)果表明：miR-185-5p抑制劑組與miR-185-5p抑制劑+vector組的miR-185-5p表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），miR-185-5p抑制劑+ sh-H19組的miR-185-5p表達(dá)水平與miR-185-5p抑制劑組相比顯著升高（P＜0.05）（圖5，A）。添加miR-185-5p抑制劑檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示：抑制miR-185-5p表達(dá)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性顯著增加，miR-185-5p抑制劑+ sh-H19組細(xì)胞增殖活性miR-185-5p抑制劑組相比，顯著降低（P＜0.05）（圖5，B）。Western blot法檢測MC3T3-E1細(xì)胞中調(diào)控增殖的蛋白ki67表達(dá)變化，結(jié)果顯示：miR-185-5p抑制劑組與miR-185-5p抑制劑+vector組與對照組相比ki67表達(dá)增高（P＜0.05）；miR-185-5p抑制劑+ sh-H19組與對照組相比ki67表達(dá)無差異（P＞0.05）（圖5，C）。

圖5 CCK8，western blot法檢測 sh H19及miR-185-5p抑制劑對增殖活性的影響

3 討論

骨折是一種常見的疾病，由創(chuàng)傷引起，并伴有骨脆性。在美國，每年大約有600萬成年人患有骨折［7］。骨折的愈合是一個復(fù)雜的生理過程，涉及生物和機(jī)械因素。成骨細(xì)胞是間充質(zhì)細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化［8，9］。因此，揭示成骨細(xì)胞對增殖、凋亡和分化的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)：抑制LncRNA H19會抑制AKT的磷酸化，進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞的增殖。這對我們骨的增殖分化提供了新的臨床思路。

長非編碼rna（long non-coding RNAs，LncRNAs）是一種長度超過200個核苷酸，不編碼任何蛋白質(zhì)的rna，在多功能水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)。某些lncRNAs已被廣泛用于不同疾病的診斷和治療，具有潛在和臨床實用價值［10］。先前的一項研究表明，lncRNAs可廣泛存在于癌癥和某些特定非腫瘤性疾病的血液樣本（血漿或血清）中［11］。這為探索疾病的發(fā)病機(jī)制提供了一個新的方向。近年來，許多l(xiāng)ncRNAs已被確認(rèn)并被證明在各種疾病中發(fā)揮著重要作用，包括心血管系統(tǒng)疾病［12］、哮喘［13］、急性腎損傷［10］、糖尿病和骨質(zhì)疏松［14］。LncRNAs在骨代謝中起重要作用，參與骨代謝的發(fā)育和轉(zhuǎn)化，尤其是對成骨細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中［15］。有研究表明，LncRNA H19可以通過激活Wnt信號來促進(jìn)成骨分化，也可以通過粘著斑激酶（FAK）介導(dǎo)機(jī)械張力誘導(dǎo)的成骨作用［16］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，H19可以通過促進(jìn)AKT磷酸化促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。然而，H19在分化成骨細(xì)胞中的潛在作用有待進(jìn)一步擴(kuò)大研究。

MicroRNAs（miRNAs）是一種小的、非編碼的RNA分子，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。此外，miRNAs參與多種細(xì)胞過程［17］。越來越多的證據(jù)表明，一些miRNAs調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化過程［18］。這些發(fā)現(xiàn)表明miRNAs在骨形成、吸收、重塑和修復(fù)中起著不可或缺的中介作用［19］。Waki等人。據(jù)報道，與標(biāo)準(zhǔn)愈合骨折相比，一些miRNAs在不愈合骨折中顯著上調(diào)，即miR-140-3p、miR-140-5p、miR-181a-5p、miR-181d-5p和miR-451a23。近年來，在骨折領(lǐng)域的研究已經(jīng)證實miR-185-5p參與了成骨分化細(xì)胞礦質(zhì)化。然而，miR-185-5p在成骨分化細(xì)胞中增殖的潛在調(diào)控機(jī)制尚不清楚。lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，包括骨代謝過程中起著重要作用。一項研究報告miR-185-5p通過Dlx2抑制作用與成骨分化相關(guān)［20］，這與我們的研究結(jié)果一致。根據(jù)恢復(fù)實驗，miRNA-185-5p作為H19的下游介質(zhì)，參與調(diào)節(jié)礦化相關(guān)基因的表達(dá)。已經(jīng)證明，IGF1在成骨細(xì)胞成熟過程中促進(jìn)成骨分化，并刺激成骨細(xì)胞增殖［21］。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-185-5p負(fù)調(diào)控AKT的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖?？傊?，H19-miR-185-5p-AKT調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能存在于成骨細(xì)胞的增殖分化過程中，H19通過ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用。成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化是成骨細(xì)胞骨形成的重要階段。這些發(fā)現(xiàn)也為H19/miR-185-5p/AKT信號軸與成骨甚至骨疾病的關(guān)系提供了線索。

Akt是生命系統(tǒng)中一個重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)［22］。成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為與細(xì)胞信號通路密切相關(guān)。其中PI3K/AKT信號通路對成骨細(xì)胞的增殖和礦化有重要作用。PI3K/AKT信號通路是代謝胰島素作用的主要效應(yīng)器，它參與一些基本的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、礦化、糖異生、糖原合成等［23，24］。

綜上所述，我們探討了lncRNA H19在成骨細(xì)胞中的作用。下調(diào)H19通過調(diào)節(jié)miR-185-5p/AKT軸抑制成骨細(xì)胞增殖。這一發(fā)現(xiàn)將有助于了解骨折愈合的分子機(jī)制，為骨折患者的治療提供新的思路。