毛春梅 ，高秋爽 ，肖水清 ，張玉杰

（1.新沂市人民醫(yī)院，江蘇 新沂 221400；2.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 濟(jì)南 250002；3.濟(jì)南市口腔醫(yī)院，山東濟(jì)南 250001）

0 引言

牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周疾病的主要致病菌，能產(chǎn)生大量的毒力因子，破壞牙周組織。致病島的發(fā)現(xiàn)讓人們對(duì)細(xì)菌有了不同的認(rèn)識(shí)。rag基因被確定為牙齦卟啉單胞菌的致病島基因之一。rag基因在臨床菌株中有4種不同的基因型，不同基因型的致病能力也不同[1-2]。本研究利用多重PCR技術(shù)檢測(cè)青少年牙齦炎患者齦溝液中的牙齦卟啉單胞菌致病島rag基因的不同基因型，分析不同基因型致病島基因在疾病發(fā)生中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇濟(jì)南市口腔醫(yī)院牙周科就診的青少年牙齦炎初診患者89例組成牙齦炎組，年齡12～16歲，平均年齡14.3歲；選擇42例牙周健康者組成對(duì)照組，年齡12-16歲，平均14.6歲；均為山東地區(qū)常住居民。要求患者無系統(tǒng)性疾病，半年內(nèi)未接受過系統(tǒng)的牙周治療，而且未服用引起牙齦增生的藥物和抗生素，且知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 采集標(biāo)本

采用無菌紙尖法采集患者齦溝液。

1.2.2 齦溝液及標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取

標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA采用DNA提取試劑盒提取。齦溝液DNA采用加熱裂解法提取。

1.2.3 牙齦卟啉單胞菌和rag基因型引物的設(shè)計(jì)及合成[1,3]（表1）。

表1 P.gingivalis 16S rDNA和4種rag基因型的引物序列

1.2.4 PCR檢測(cè)

以16S rDNA為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定牙齦卟啉單胞菌陽性患者；以牙齦卟啉單胞菌陽性患者DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，確定rag基因陽性患者。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，用χ2檢驗(yàn)比較組間檢出率的差異：P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 普通PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 P.gingivalis 16S rDNA PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

陽性對(duì)照 a 和臨床標(biāo)本 c ～ e，g～i, k～l均擴(kuò)增出 404 bp目的條帶，空白對(duì)照b和臨床標(biāo)本f, j及陰性對(duì)照m, n未見目的條帶。見圖1；

圖1 P.gingivalis 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖

2.1.2 多重PCR檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)菌株b和臨床標(biāo)本e, i均擴(kuò)增出628bp（rag-1）目的條帶，臨床標(biāo)本h擴(kuò)增出979bp（rag-2）目的條帶, 臨床標(biāo)本c, d, f, g, j擴(kuò)增出423bp（rag-3）目的條帶, 標(biāo)準(zhǔn)菌株a和臨床標(biāo)本f, j均擴(kuò)增出739bp（rag-4）目的條帶。見圖2。

圖2 4種rag基因型特異性引物PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果

PCR技術(shù)檢測(cè)131例患者臨床標(biāo)本，其中牙齦炎組檢測(cè)出63例，陽性率70.79%；對(duì)照組檢測(cè)出15例，陽性率35.71%。牙齦炎組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

多重PCR技術(shù)檢測(cè)78例P.gingivalis陽性患者臨床標(biāo)本，檢測(cè)出rag基因的有61例，陽性率78.21%, 其中牙齦炎組54例，陽性率85.71%；對(duì)照組7例，陽性率46.67%。牙齦炎組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（見表1）。

表1 普通PCR及多重PCR對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果（n，%）

2.3 不同rag基因型P.gingivalis菌株的分布

4種rag基因型，P.gingivalis菌株的分布情況見表2。從檢出率來看，rag-3型的檢出率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 4種Rag基因型P.gingivalis臨床菌株的分布情況[n（%）]

3 討論

牙齦卟啉單胞菌是革蘭陰性、專性厭氧、產(chǎn)黑色素桿菌，是慢性牙周炎的主要致病菌之一，它能夠產(chǎn)生大量的毒力因子及內(nèi)毒素、吲哚、有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致牙周組織的破壞[4-5]。病原菌致病是多種因素共同作用的結(jié)果，致病島的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)細(xì)菌致病性有了更深入的認(rèn)識(shí)[6]。目前，rag位點(diǎn)被確定是P.gingivalis的致病島基因之一[1,7]。該位點(diǎn)主要含有ragA和ragB。

以往的研究表明rag位點(diǎn)在臨床菌株中有4種不同的分型，rag-1型最早是在 PgW50中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn) Pg W83 也攜帶 rag-1型，菌株 AO11/9 中發(fā)現(xiàn) rag-2 型，菌株 QM220 中發(fā)現(xiàn) rag-3 型，菌株 ATCC33277 中發(fā)現(xiàn) rag-4 型。不同基因型菌株致病能力亦不同。有研究表明牙齦卟啉單胞菌脂多糖可抑制中性多形核白細(xì)胞凋亡，但中性多形核白細(xì)胞數(shù)量的增加導(dǎo)致其在炎癥部位堆積、引起巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向炎癥部位聚集、炎性因子釋放，從而加重牙周的炎癥[8]。郭懷興等采用 Annexin V-Light 650 /PI檢測(cè)中性多形核白細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，不同 rag 型基因?qū)χ行远嘈魏税准?xì)胞凋亡作用并不相同，rag-1 型抑制細(xì)胞凋亡作用顯著低于rag-2型及rag-4型，rag-4型抑制作用最弱，說明不同rag基因型牙齦卟啉單胞菌對(duì)中性多形核白細(xì)胞的抑制作用不同[8]。也有報(bào)道指出rag 位點(diǎn)不同基因分型的牙齦卟啉單胞菌菌株在不同地區(qū)、種族存在一定的差異性。有報(bào)道 rag-1 型牙齦卟啉單胞菌在慢性牙周炎中的檢出率最高，其次為 rag-3 型; 提示rag-1型和rag-3型 牙齦卟啉單胞菌與中國(guó)某些地區(qū)人群慢性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。

多重PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性的引物，針對(duì)同一模板的多個(gè)區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)。本研究建立了檢測(cè)4種rag基因型的多重PCR技術(shù)，研究證實(shí)所建立的多重PCR技術(shù)具有較高的敏感性和特異性。本研究采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)本地區(qū)青少年牙齦炎患者齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的rag基因型，發(fā)現(xiàn)同一標(biāo)本中可檢測(cè)出不同基因型的牙齦卟啉單胞菌。本研究中78例牙齦卟啉單胞菌陽性患者臨床標(biāo)本，檢測(cè)出rag基因的有61例，陽性率78.21%, 其中rag-1型占14.75%，rag-2型9.83%，rag-3型49.18%，rag-4型26.23%。從檢出率來看，rag-3型的檢出率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果表明rag-3型牙齦卟啉單胞菌與本地區(qū)青少年牙齦炎的發(fā)生發(fā)展最為密切。