田存章賀新平萬(wàn)嘉欣姬國(guó)杰周紅偉崔靖吳文龍

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生物與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

菊花是菊科植物菊的干燥頭狀花序，懷菊花作為河南4大懷藥之一，其氣清香，味甘、苦，具有清熱解毒、清肝明目等功效[1]，具有極高的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)代藥理研究表明，菊花具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降血脂等藥理活性[2]。

植物內(nèi)生菌指某些微生物在其生活史的一定階段或全部階段寄生于健康植物體內(nèi)、又不引起宿主植物明顯病害癥狀的微生物，其與宿主存在著和諧共生關(guān)系[3]。內(nèi)生菌普遍存在于植物的各種組織、器官及細(xì)胞間隙當(dāng)中，具有豐富的生物多樣性，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。內(nèi)生菌包括內(nèi)生細(xì)菌、放線(xiàn)菌和真菌。近年來(lái)，植物內(nèi)生細(xì)菌作為重要的微生物資源，其可能參與植物的生理活動(dòng)和代謝，給植物帶來(lái)新的變化和功能，很多研究表明,藥用植物的內(nèi)生細(xì)菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性物質(zhì)，其代謝產(chǎn)物具有抗菌、降血壓、保護(hù)心血管等多種藥理作用。張國(guó)榮等人研究報(bào)道,藥用植物川芎可分離出產(chǎn)生川芎嗪的5株枯草芽孢桿菌，其產(chǎn)物川芎嗪具有改善微循環(huán)、保護(hù)心血管、防止血栓形成等多種藥理作用[4]。李玲玲采用瓊脂塊法和雙層平板法對(duì)從藥用植物青蒿中分離的內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)19株內(nèi)生細(xì)菌中有18株具有抑菌活性，抑菌活性菌株的比例最高，達(dá)到了95%[5]。鞠鑫等從人參中分離得到內(nèi)生假單胞菌G13476，通過(guò)MTT、Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株G13476次級(jí)代謝產(chǎn)物可下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌的抑制作用[6]。

高通量測(cè)序技術(shù)是目前研究微生物的群落及種類(lèi)信息的常用技術(shù)手段，具有信息量大、可靠性高、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，李秋樺等應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)7種不同品種的梨內(nèi)生細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究分析，為進(jìn)一步研究梨與內(nèi)生細(xì)菌間的互作關(guān)系奠定了一定基礎(chǔ)[7]；劉蓬蓬等基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黃芪內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA的區(qū)域序列進(jìn)行分析，從而確定了黃芪內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群和菌群生物多樣性[8]。目前，關(guān)于植物內(nèi)生細(xì)菌的研究報(bào)告很多，但有關(guān)藥用菊花懷菊內(nèi)生細(xì)菌的研究報(bào)道相對(duì)較少，本研究以藥用懷菊為試驗(yàn)材料，基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)懷菊不同部位內(nèi)生細(xì)菌分布及群落特征進(jìn)行初步分析，以期為懷菊花內(nèi)生細(xì)菌資源的合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。本研究為懷菊內(nèi)生菌資源的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了一定的理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

懷菊，于2020年11月采自河南省新鄉(xiāng)市武陟縣。

1.2 試劑與儀器

基因組提取試劑盒，OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒，Thermo Fisher Scientific公司；Pico-21臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Fisher公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司；Qubit?3.0熒光計(jì)，Invitrogen公司；ETC 811PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 樣品材料表面消毒

選擇生長(zhǎng)良好懷菊，采樣后用水沖洗干凈，吸取水分后，將其部分莖、葉、花材料置于超凈工作臺(tái)中紫外燈照射20min，之后用10%的次氯酸鈉溶液浸泡處理5min，無(wú)菌水沖洗3～6次，用無(wú)菌濾紙吸取多余水分，備用。

1.4 消毒可靠性檢測(cè)

1.4.1 漂洗液培養(yǎng)

用最后一次沖洗消毒后試驗(yàn)材料的無(wú)菌水涂布平板，37℃條件下培養(yǎng)24h后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，以檢測(cè)表面消毒的可靠性。

1.4.2 組織印跡檢測(cè)

參考李玲玲等實(shí)驗(yàn)方法[3]，用無(wú)菌鑷子夾住已消毒處理過(guò)的供試植物材料，使其消毒表面與相應(yīng)固體培養(yǎng)基充分接觸3～5min后取出，于適當(dāng)條件下培養(yǎng)24h，以檢測(cè)表面消毒的可靠性。

1.5 內(nèi)生細(xì)菌的多樣性檢測(cè)

1.5.1 樣品總DNA的提取

分別取適量懷菊莖、葉、花樣品于2mL無(wú)菌離心管中，經(jīng)破碎儀破碎后，參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒方法提取基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，并使用Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行精確定量。

1.5.2 PCR擴(kuò)增及其測(cè)序

以提取的總DNA為模板對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)域序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增參照張雙虹等兩輪PCR擴(kuò)增方法[9]。高通量測(cè)序由生工生物工程股份有限公司基于Illumina MiseqTM/HiseqTM高通量測(cè)序平臺(tái)完成。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理

將得到的測(cè)序序列，使用Cutadapt軟件去除引物接頭序列，使用PEAR軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行拼接，根據(jù)樣本中標(biāo)簽序列和引物序列從拼接數(shù)據(jù)中分割出各樣本數(shù)據(jù)，并使用PRINSEQ切除部分低質(zhì)量值序列，過(guò)濾掉低復(fù)雜度的序列，最終得到有效測(cè)序數(shù)據(jù)。使用Usearch軟件對(duì)個(gè)樣本優(yōu)化序列按照97%相似水平上進(jìn)行OTU聚類(lèi)；再對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性指數(shù)等進(jìn)行分析，探索懷菊內(nèi)生菌的種群分布特征及多樣性。測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 結(jié)果分析

2.1 懷菊材料消毒可靠性檢測(cè)

懷菊試驗(yàn)材料消毒后最后一次漂洗液培養(yǎng)和組織印記培養(yǎng)，結(jié)果表明,培養(yǎng)基中均無(wú)微生物菌落長(zhǎng)出，表明試驗(yàn)材料消毒滅菌可靠。

2.2 懷菊不同部位內(nèi)生細(xì)菌測(cè)序有效序列長(zhǎng)度分布

懷菊莖、葉、花不同部位高通量測(cè)序得到的原始序列質(zhì)控后得到V3-V4區(qū)域的有效序列數(shù)在63797～77327條，有效序列合計(jì)為215632條，長(zhǎng)度在357～474bp，平均長(zhǎng)度為407bp，菊花莖、葉、花測(cè)序質(zhì)控后得到有效序列分別為77327、74508和63797條，見(jiàn)表1。

表1 有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 懷菊不同部位內(nèi)生細(xì)菌OUT、多樣性分析

按照97%相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)，一個(gè)OUT的序列被認(rèn)為可能是來(lái)自于同一個(gè)種屬的序列，懷菊有效序列共聚成57個(gè)OTUs，排除未分類(lèi)細(xì)菌類(lèi)型后，分屬10個(gè)細(xì)菌門(mén)、17個(gè)細(xì)菌綱、23個(gè)細(xì)菌目、27個(gè)細(xì)菌科和25個(gè)細(xì)菌屬。由表2可知，菊花莖、葉、花分布聚成54、54和51個(gè)OTUs。所有樣品的OTU覆蓋度均大于99.9%，說(shuō)明樣品的覆蓋度很廣，測(cè)序結(jié)果可反映樣品中內(nèi)生細(xì)菌群落組成的真實(shí)情況。去除未分類(lèi)細(xì)菌類(lèi)型后，懷菊莖聚成的可分類(lèi)OUT序列分屬10個(gè)細(xì)菌門(mén)、16個(gè)細(xì)菌綱、23個(gè)細(xì)菌目、27個(gè)細(xì)菌科和25個(gè)細(xì)菌屬，懷菊葉聚成的可分類(lèi)OUT序列分屬10個(gè)細(xì)菌門(mén)、16個(gè)細(xì)菌綱、22個(gè)細(xì)菌目、26個(gè)細(xì)菌科和23個(gè)細(xì)菌屬，懷菊花聚成的可分類(lèi)OUT序列分屬10個(gè)細(xì)菌門(mén)、16個(gè)細(xì)菌綱、22個(gè)細(xì)菌目、25個(gè)細(xì)菌科和22個(gè)細(xì)菌屬，說(shuō)明懷菊不同部位的內(nèi)生細(xì)菌在分類(lèi)階元在數(shù)量上存在差異。

由表2可知，結(jié)合菊花不同部位內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)中的Shannon、Simpson、Chao和Ace指數(shù)分別在0.30～0.62、0.67～0.88、51.75～54.75和52.02～55.17；說(shuō)明懷菊不同部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)存在一定的差異。綜合分析4個(gè)多樣性指數(shù)，顯示菊花花中內(nèi)生細(xì)菌多樣性較高，葉中多樣性最低，而莖中的群落豐富度較高，花中的群落豐富度最低。在屬水平上，菊花不同部位的內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌均為Streptophyta屬，其在菊花莖、葉、花中占比分別為87.21%、93.85%和79.93%，另外，分別有2個(gè)菌屬為懷菊莖、葉所特有，Capnocytophaga和Asticcacaulis菌屬為懷菊莖特有菌，2個(gè)未分類(lèi)菌屬為懷菊葉所特有。研究結(jié)果表明，菊花不同部位內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異。

表2 內(nèi)生細(xì)菌Alpha多樣性

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以懷菊為研究材料，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)懷菊不同部位內(nèi)生細(xì)菌的組成及分布特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)懷菊不同部位的內(nèi)生細(xì)菌在某些分類(lèi)階元在數(shù)量上存在差異。通過(guò)對(duì)懷菊不同部位內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，表明菊花不同部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)存在一定的差異，顯示菊花花中內(nèi)生細(xì)菌多樣性較高，莖次之，而葉最低。菊花不同部位的內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌均為Streptophyta屬，Capnocytophaga和Asticcacaulis菌屬為懷菊莖特有菌，2個(gè)未分類(lèi)菌屬為懷菊葉所特有，說(shuō)明菊花不同部位內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異。