鐘舒潔 陳曉嘉 周芳梅 羅小寶 陳茹 馮志強

摘 要：以市場隨機購買的普洱茶為研究對象，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）、高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）、超高效液相色譜-串聯質譜聯用法（UPLC-MS/MS）對普洱茶茶葉進行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2檢測，分析3種方法檢測普洱茶中黃曲霉毒素的適用性以及茶葉中黃曲霉毒素含量情況。結果表明，ELISA法測得結果為8.94～588μg/kg，HPLC法測得結果為0.318～0.677μg/kg，UPLC-MS/MS法結果均為未檢出。UPLC-MS/MS法具有選擇性強、重現性好、穩(wěn)定性高的特點，對普洱茶茶葉這種基質復雜的樣品進行測定，能減少雜質干擾，有效避免假陽性結果，更適用于檢測茶葉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量。

關鍵詞：普洱茶;黃曲霉毒素;酶聯免疫法;高效液相色譜法;超高效液相色譜-串聯質譜聯用法

中圖分類號 TS272.7 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）16-0015-05

Determination of Aflatoxin in Pu-erh Tea by UPLC-MS/MS， HPLC and ELISA

ZHONG Shujie1，3 et al.

（1Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China; 3Guangdong Provincial Food Industry Public Laboratory， Guangzhou 511442， China）

Abstract： In this paper， Pu-erh tea was purchased in the market as the main experimental object， using enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）， high performance liquid chromatography fluorescence detection （HPLC-FLD）， ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） for the determination of aflatoxin B1， B2， G1 and G2 in Pu-erh tea. Studied the three methods detection of aflatoxin in Pu-erh tea， applicability and aflatoxin content in tea. The result of ELISA method was 8.94-588μg/kg，the result of HPLC method was 0.318-0.677μg/kg， and the result of UPLC-MS/MS method was not detected. The UPLC-MS/MS method has the characteristics of strong selectivity， good reproducibility and high stability. It can reduce the interference of impurities and avoid false positive results. It is more suitable for the detection of the content of aflatoxin B1， B2， G1 and G2 in tea.

Key words： Pu-erh; Aflatoxin; Enzyme linked immunosorbent assay; High performance liquid chromatography; Ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

普洱茶[1]是以云南大葉種曬青茶為原料，采用特定的加工工藝制成具有獨特品質特征的茶葉，具有抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、抗輻射、抑菌、預防心腦血管疾病、增強免疫力、降脂減肥、降血糖、緩解煙毒危害等功效[2-4]。當前，普洱茶的質量安全問題倍受社會關注，近年來流傳的“普洱茶致癌說”將質量安全問題推到了風口浪尖，是普洱茶生產、流通領域的重大挑戰(zhàn)。黃曲霉毒素（aflatoxins）是自然界中已知的理化性質最穩(wěn)定的一類真菌毒素，具有強毒性、致癌性、致突變性和致畸毒性，其中黃曲霉毒素B1的毒性最大[5-7]，被世界衛(wèi)生組織（WHO）癌癥研究機構劃定為一類致癌物，是世界公認的三大強致癌物質之一[8-10]。

目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有酶聯免疫吸附法（ELISA）[11-12]，色譜法如薄層色譜法（TLC）[13]、高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）[14-16]、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[17-23]和毛細管電泳法[24]等。茶葉基質復雜（含有多達數百種化學成分），雜質干擾嚴重，進行真菌毒素檢測時容易出現假陽性，研究茶葉中真菌毒素含量是食品安全檢測技術研究的難點和熱點[25]。陳若恒等[26]采用免疫親和柱凈化-酶聯免疫吸附（ELISA）法對荔灣區(qū)茶葉批發(fā)市場140份普洱茶AFTB1污染狀況進行檢測，陽性率為5.71%，檢出值范圍在2.03～4.29μg/kg。陳建玲等[27]采用免疫親和柱凈化-液相色譜法（HPLC）對抽取的70份濕倉儲存普洱茶樣本，檢得黃曲霉毒素B1檢出值范圍在0.021～8.164μg/kg。李亞莉[28]采用多功能凈化柱-超高效液相色譜質譜法（LC-MS/MS）對收集的30份發(fā)酵階段樣的普洱茶、市售普洱茶及受污染普洱茶進行黃曲霉毒素檢測，均未檢測到黃曲霉毒素。

本研究以市場隨機購買的普洱茶為試驗對象，采用酶聯免疫法、液相色譜法和超高效液相色譜-串聯質譜法對普洱茶中的黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2（AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2）進行檢測，旨在探尋3種不同檢測方法之間的差異性，以便在實際工作中合理選擇適用的方法，提高結果準確性，同時為普洱茶質量安全及飲用安全提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters H-class（UPLC）超高效液相色譜儀（美國Waters公司）串聯Triple Quad 3500超高液相質譜聯用儀（美國AB SCIEX公司）;Agilent 1200（FLD檢測器）高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;Vector PCX柱后衍生器（美國Pickering公司）;RT-6000酶標儀（德國IFP公司）;Turbo Vap LV 50位自動氮吹濃縮儀（瑞典Biotage公司）;AG204電子分析天平（瑞士Mettler Toledo）。

1.2 試劑與耗材 黃曲霉毒素混標（純度98%，美國O2SI公司）、乙腈（色譜純，默克）、碘（分析純，廣州化學試劑廠）、氯化鈉（分析純，廣州化學試劑廠）、十二水磷酸氫二鈉（分析純，天津市化學試劑一廠）、磷酸二氫鉀（分析純，廣州化學試劑廠）、氯化鉀（分析純，廣州化學試劑廠）、吐溫-20（分析純，阿法埃莎（天津）化學有限公司）、甲醇（分析純，天津市化學試劑一廠）、氫氧化鈉（分析純，廣州化學試劑廠）、黃曲霉毒素ELISA試劑盒（美國Romer Labs公司）、特異性免疫親和柱（美國Romer Labs公司）。

1.3 樣品采集 于2017年7—10月份隨機抽取廣州某茶葉市場共86批次普洱茶樣品，其中生茶46批次，熟茶40批次。取一定量的茶樣，經高速粉碎機磨細后過20目篩備測。

1.4 方法

1.4.1 酶聯免疫吸附測定法（ELISA法） 參照ELISA檢測試劑盒所提供的方法。主要檢測步驟為：取5.0g待測樣品加入25mL70%甲醇水溶液進行提取，超聲30min，提取液用分析緩沖液按照1∶2比例進行稀釋后，每個ELISA稀釋孔中加入100μL樣品、200μL酶連偶合物，充分混合后移取100μL混合液至有抗體包被的微孔中，同時設立標準品系列和對照反應孔，混合后于室溫下孵育15min，再用蒸餾水或去離子水洗板5次后加入反應底物100μL，置室溫下孵育5min后用終止液終止ELISA反應，在450nm波長下測定吸光度OD值。根據標準曲品系列濃度以及相關的OD值，繪出標準工作曲線，利用該標準曲線求出相應的含量值。

1.4.2 高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD法）

1.4.2.1 前處理過程 取5.0g待測樣品加入25mL70%甲醇水溶液進行提取，超聲30min，取2mL提取液加入18mL吐溫溶液，全部過免疫性親和柱，先用5mL PBS溶液和5mL水活化親和柱后，上樣，用2mL甲醇洗脫，抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中，在50℃下用氮氣將洗脫液吹至近干，用50%甲醇水定容至1.0mL，旋渦1min復溶，過0.22μm有機濾膜壓濾上機。

1.4.2.2 儀器條件 液相色譜條件：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動相：水-甲醇-乙腈（56+22+22）;等度洗脫;流速1.0mL/min;進樣量50μL;柱溫40℃;激發(fā)波長360nm;發(fā)射波長440nm;柱后衍生器系統(tǒng)：衍生溶液：0.005% 碘液;衍生溶液流速0.3mL/min;衍生反應管溫度90℃;激發(fā)波長360nm;發(fā)射波長440nm。

1.4.3 超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS法）

1.4.3.1 前處理過程 取5.0g待測樣品加入25mL70%甲醇水溶液進行提取，超聲30min，取2mL提取液加入18mL吐溫溶液，全部過免疫性親和柱，先用5mL PBS溶液和5mL水洗滌，再用2mL甲醇洗脫，抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中，在50℃下用氮氣將洗脫液吹至近干，用50%甲醇水定容至1.0mL，旋渦1min復溶，壓濾上機。

1.4.3.2 儀器條件 液相色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱（2.1mm×50mm，1.7μm），流動相：0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水，流速為0.5mL/min;進樣量10.0μL;柱溫40℃;梯度洗脫，見表1。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI+），正離子掃描方式，多反應監(jiān)測模式（MRM），電噴霧電壓為5500V，離子源溫度為550℃，氣簾氣（CUR），壓力為38psi，霧化氣壓力（GAS1）為55psi，輔助加熱氣壓力（GAS2）為60psi。黃曲霉毒素AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2的其他相關質譜參數見表2。

2 結果與分析

2.1 ELISA法測定結果 在隨機抽取的86份茶葉樣品中，采用ELISA法檢測時，黃曲霉毒素全部呈陽性，最高檢測含量為588μg/kg，檢出率為100%（見表3）。ELISA法檢測結果顯示，所測茶葉中黃曲霉毒素均有檢出。ELISA方法原理為酶標記抗體與載體上的抗原或抗體結合發(fā)生顯色發(fā)應進行定性定量。ELISA法具有操作快速、簡單并且成本低等優(yōu)點，但對基質復雜的樣品特異性不強，容易受基質干擾產生假陽性。茶葉中的酚類物質對抗原抗體反應有著嚴重的干擾，需要去除酚類物質的干擾才會得到準確的結論。

2.2 HPLC-FLD法測定結果 在隨機抽取的86份茶葉樣品中，采用HPLC-FLD法檢測，結果顯示，普洱茶生茶中有5份樣品中黃曲霉毒素呈陽性，檢出率為4.5%，陽性樣品最高檢測含量為0.677μg/kg（見表4）。液相色譜見圖1、圖2。

HPLC-FLD檢測結果顯示，5批次普洱茶生茶中檢出AFTB2。HPLC-FLD法采用特異性免疫親和柱進行凈化，對目標物進行柱后衍生后進入熒光檢測器進行分析檢測，該方法相對ELISA法特異性更強，有效降低干擾。HPLC-FLD法原理是以分析物的保留時間作定性依據，由于實際樣品測定時基質比較復雜，基質中的組分與分析物極性相似，從而保留時間相似，導致出現假陽性情況，使結果誤判。而茶葉基質復雜（含有多達數百種化學成分），在液相色譜分析中容易在同一出峰時間產生雜峰，干擾影響定性結果。

2.3 UPLC-MS/MS法測定結果 在隨機抽取的86份茶葉樣品中，采用UPLC-MS/MS法檢測，結果顯示，全部樣品檢測結果均呈陰性，檢出率為0（見表5）。質譜MRM離子見圖3。

UPLC-MS/MS法具有選擇性強、重現性好、穩(wěn)定性高的特點，根據分子量信息及其特征離子進行定性定量分析檢測，在串聯四級桿多反應監(jiān)測（MRM）模式下，所選的定量離子和定性離子具有很高的特異性，各目標物質分析時均不存在干擾。對茶葉這種基質復雜的樣品能有效對目標離子進行準確定性，屏蔽雜質干擾，進而有效地避免假陽性或者假陰性結果。

2.4 3種檢測方法的對比

2.4.1 檢出限、定量限、回收率與精密度 本試驗考察了酶聯免疫吸附法（ELISA）、高效液相色譜-熒光檢測方法（HPLC-FLD）與超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜法（UPLC-MS /MS）的相關系數、回收率、精密度、檢出限（LOD）和定量限（LOQ），其結果見表6。經標準曲線測試，ELISA法測4種黃曲霉毒素總量在0.1～40ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數為0.9985，LOD為1μg/kg，LOQ為3μg/kg;HPLC-FLD法在0.1～40ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數為0.9991～0.9996，LOD為0.1μg/kg，LOQ為0.5μg/kg;UPLC-MS/MS法在0.1～10ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數為0.9991～0.9997，LOD為0.03μg/kg，LOQ為0.1μg/kg。HPLC-FLD法進行0.1μg/kg、0.3μg/kg和1.0μg/kg添加水平的測定，加標回收率為48.3%～76.4%，譜圖顯示有明顯的基質干擾，相對標準偏差（RSD）為3.1%～5.8%;UPLC-MS/MS法進行0.1μg/kg、0.3μg/kg和1.0μg/kg添加水平的測定，加標回收率為71.9%～86.7%，相對標準偏差（RSD）為2.4%～3.6%。綜上所述，UPLC-MS/MS的靈敏度、回收率、重現性及穩(wěn)定性都優(yōu)于另外2種方法。

2.4.2 檢測結果 從表7可以看出，ELISA法與HPLC法檢測茶葉中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2均出現陽性結果，UPLC-MS/MS均為陰性結果。HPLC-FLD方法原理是利用分析物的保留時間作定性依據，外標物進行定量，茶葉樣品基質復雜，基質中的組分與分析物極性等化學性質相同情況下會造成相似或相同的保留時間影響定性結果從而導致誤判。UPLC-MS/MS方法原理采用分析物的保留時間和結構離子碎片作為定性依據，定性結果更為準確。在分析物定性方面，UPLC-MS/MS方法優(yōu)于HPLC-FLD方法，樣品經過特異性免疫親和柱后，可有效去除茶葉的復雜基質，實現對目標物質的凈化。在MRM掃描模式下，能準確、快速地檢測茶葉中的黃曲霉毒素含量，有效地避免假陽性結果。免疫親和凈化-超高效液相色譜串聯質譜法具有快速、準確、靈敏等特點，有助于提高食品檢測實驗室的分析效率，降低成本，從而為茶葉中的黃曲霉毒素含量的測定提供參考。

3 結論

本研究采用酶聯免疫吸附法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）、超高效液相色譜-串聯質譜聯用法（UPLC-MS/MS）法對普洱茶樣品進行黃曲霉毒素分析檢測，分析3種方法檢測普洱茶中黃曲霉毒素的適用性及普洱茶中黃曲霉毒素的含量情況。結果表明，ELISA法測得結果為8.94～588μg/kg，HPLC法測得結果為0.318～0.677μg/kg，UPLC-MS/MS法結果均為未檢出。UPLC-MS/MS法具有選擇性較強、重現性好、穩(wěn)定性高、靈敏度高的特點，對茶葉這種基質復雜的樣品能有效減少雜質干擾，有效避免假陽性結果。

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（責編：張宏民）