賈江濤，趙慶超，楊君娜，曹興巍，樊慶勝

胃癌是導致人類死亡的重大因素之一， 其發(fā)生發(fā)展機制十分復雜， 與包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA） 在內的多種基因的調控密切相關。 研究顯示，lncRNA PlncRNA-1（又名CBR3-AS1）在胃癌組織中表達上調，且與患者總生存率、TNM 分期、腫瘤分級、腫瘤類型等相關臨床病理特征顯 著相 關［1-2］。 PlncRNA-1 在多種腫瘤包括膽管癌、 視網(wǎng)膜母細胞瘤和前列腺癌等中發(fā)揮著重要的致癌作用， 但其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制并不清楚［3-5］。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，PKB/AKT） 信號通路調節(jié)細胞生長、細胞遷移和細胞代謝等多種生物學事件，還參與調節(jié)腫瘤進程［6］。 本研究通過觀察 PlncRNA-1 在胃癌SGC-7901 細胞中的表達情況， 并分析其對SGC-7901 細胞增殖、周期和凋亡和PI3K/AKT 通路的影響，探討其可能的作用機制，以期為胃癌的治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PlncRNA-1-siRNA （上海吉瑪），cDNA 第一鏈合成試劑盒 （上海碧云天），DMEM 培養(yǎng)基、 脂質體 2000、Trizol 試劑、 噻唑藍 ［3-（4，5-Dimethylthiazol -2 -yl） -2，5 -diphenyltetrazolium bromide，MTT］溶液（北京索萊寶），實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，qPCR）試劑盒（杭州主諾生物技術有限公司），總蛋白提取試劑盒、 細胞周期檢測試劑盒和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI） 雙染細胞凋亡檢測試劑盒 （上海貝博生物），PI3K、AKT、磷酸化（phospho，p）-AKT、細胞周期素 D1（CyclinD1）和 B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（英國 Abcam 公司）。

1.2 細胞分組與轉染 采用含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基在5%二氧化碳、濕度飽和、37℃恒溫培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)來自中國科學院細胞庫的胃癌SGC-7901細胞和正常胃黏膜上皮細胞GES-1。 將對數(shù)期的SGC-7901 細胞接種至6 孔板上， 待培養(yǎng)至70% ~80%融合度時，參照脂質體2000 說明書進行瞬時轉染。 其中，轉染PlncRNA-1-siRNA 的細胞記為干擾組，轉染陰性對照siRNA 的細胞記為陰性組，將正常培養(yǎng)的細胞作為未轉染組，其中每組設置3 個復孔。 轉染48 h 后，收集各組細胞并采用qPCR 檢測細胞中PlncRNA-1 表達以評價轉染效果。

1.3 qPCR 檢測 參照Trizol 試劑說明書步驟抽提 SGC-7901 細胞總 RNA 后， 根據(jù) cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書合成單鏈cDNA， 以此為模板，按照qPCR 試劑盒說明書步驟進行PCR 擴增，并采用2-△△Ct 法計算PlncRNA-1 表達水平。重復3次。 其中，PCR 擴增反應參數(shù)：95℃ 6 min，95℃20 s、58℃ 30 s，40 個循環(huán)； 由上海生工生物工程股份有限公司合成的PCR 引物序列如下：PlncRNA-1上游：5’-GCGGGAGTC TTCCTTAGCTT-3'，下游：5'-GGTCACGGTCTTATCGAGGA-3'；內參 β-actin上游：5'-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3'，下游：5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3'。

1.4 MTT 實驗 將對數(shù)期的SGC-7901 細胞種植到96 孔板上后，置于細胞培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)；待細胞融合度達70%以上時， 按照1.2 中的分組轉染細胞；待轉染 1、2、3 和 4 d 后，棄培養(yǎng)液，加入 MTT 試劑孵育4 h； 以二甲基亞砜充分溶解MTT 結晶后，采用全自動酶標儀檢測SGC-7901 細胞的光密度（optic density，OD）值。 重復 3 次。

1.5 流式細胞儀檢測 （1）細胞周期檢測：收集轉染48 h 后的干擾組、 陰性組和正常培養(yǎng)的未轉染組SGC-7901 細胞，以磷酸緩沖液漂洗2 次后，4℃下離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 10 min 收集細胞；以預冷的70%乙醇4℃下固定過夜后，離心收集細胞；以預冷的磷酸緩沖液調整細胞濃度。向含有105 個細胞液中加入碘化丙啶（PI）染色液染色15 min 后， 采用流式細胞儀檢測SGC-7901細胞周期分布情況。 重復 3 次。 （2）細胞凋亡檢測：收集各組細胞后，以磷酸緩沖液漂洗2 次；離心收集細胞后，用結合緩沖液重懸細胞；向含有105個細胞液中加入Annexin V-FITC 和PI 避光雙染15 min 后， 上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。重復3 次。

1.6 免疫印跡法檢測 參照總蛋白提取試劑盒說明書抽取SGC-7901 細胞總蛋白后， 采用考馬斯亮藍法檢測總蛋白的濃度與純度。 將變性后的蛋白樣品行凝膠電泳分離、轉膜和封閉后，加入按1∶2 000比例稀釋的 PI3K、AKT、p-AKT、CyclinD1、Bcl-2 和β-肌動蛋白抗體室溫孵育2 h；經(jīng)1∶5 000 比例稀釋的辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h 后， 暗室內加化學發(fā)光劑顯影曝光；采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析 SGC-7901 細胞中 PI3K、AKT、p-AKT、CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達水平，其中以β-肌動蛋白為內參進行校正。 重復3 次。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0 進行統(tǒng)計學分析。 計量資料以（）表示，兩組比較行 t 檢驗；多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗；以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PlncRNA-1 在胃癌SGC-7901 細胞和正常胃黏膜上皮細胞GES-1 中的表達 qPCR 檢測結果顯示，PlncRNA-1 在胃癌細胞SGC-7901 中的表達水平 （1.01 ± 0.07） 較正常胃黏膜上皮細胞 GES-1（0.40 ± 0.03） 明顯升高， 差異有統(tǒng)計學意義 （t =24.029，P ＜ 0.05）。

2.2 PlncRNA-1 在各組胃癌SGC-7901 細胞中的表達 qPCR 檢測結果顯示， 與未轉染組 （0.98 ±0.06） 比較， 陰性組細胞中 PlncRNA-1 表達水平（1.02 ± 0.08）差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）；與未轉染組比較， 干擾組細胞中PlncRNA-1 表達水平（0.22 ± 0.03） 明顯降低， 差異有統(tǒng)計學意義 （F=503.339，P ＜ 0.05）。

2.3 下調PlncRNA-1 表達對胃癌SGC-7901 細胞增殖的影響 四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測結果顯示，在轉染不同時間后，陰性組細胞增殖活力與未轉染組之間差異無統(tǒng)計學意義 （P ＞0.05），但干擾組細胞在轉染2、3 和4 d 后細胞增殖活力較未轉染組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表1。

表1 各組細胞轉染不同時間后各組SGC-7901 細胞的增殖變化（）

表1 各組細胞轉染不同時間后各組SGC-7901 細胞的增殖變化（）

注：與未轉染組同時間比較，aP ＜0.05；與陰性組同時間比較，bP ＜0.05

組別 1 d未轉染組 0.26 ± 0.03陰性組 0.27 ± 0.03干擾組 0.24 ± 0.02 F 值 2.864 P 值 0.077 2 d 0.43 ± 0.03 0.42 ± 0.03 0.33 ± 0.02ab 37.227＜0.001 3 d 4 d 0.66 ± 0.05 0.86 ± 0.06 0.68 ± 0.04 0.91 ± 0.06 0.45 ± 0.02ab 0.57 ± 0.03ab 97.400 112.333＜0.001 ＜0.001

2.4 下調PlncRNA-1 表達對胃癌SGC-7901 細胞周期的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，與未轉染組比較，陰性組細胞在G0/G1、S 和G2/M 期所占百分比差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；與未轉染組比較，干擾組細胞在G0/G1期所占百分比明顯升高，而在S 期和G2/M 期所占百分比明顯降低， 差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。 見表 2。

2.5 下調PlncRNA-1 表達對胃癌SGC-7901 細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，陰性組細胞凋亡率與未轉染組之間差異無統(tǒng)計學意義 （P ＞0.05）， 但干擾組細胞凋亡率較未轉染組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。 見表 2。

表2 各組細胞周期分布和細胞凋亡率的比較（%，）

表2 各組細胞周期分布和細胞凋亡率的比較（%，）

注：與未轉染組同期比較，aP ＜0.05；與陰性組同期比較，bP ＜0.05

組別 細胞周期G0/G1未轉染組 56.78 ± 1.56陰性組 56.26 ± 1.38干擾組 62.52 ± 2.30ab F 值 33.841 P 值 ＜0.001 S 細胞凋亡率G2/M 23.15 ± 1.03 23.46 ± 0.95 19.36 ± 0.52ab 62.994＜0.001 20.07 ± 0.85 5.15 ± 1.02 20.28 ± 0.42 4.36 ± 0.52 18.12 ± 0.49ab 16.82 ± 2.23ab 33.630 209.159＜0.001 ＜0.001

2.6 下調PlncRNA-1 表達對胃癌SGC-7901 細胞中PI3K/AKT 信號通路的影響 免疫印跡法檢測結果顯示， 陰性組和未轉染組細胞中PI3K/AKT 信號通路相關蛋白 PI3K、AKT、p-AKT、CyclinD1 和 Bcl-2 蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），但干擾組 PI3K、p-AKT、CyclinD1 和 Bcl-2 蛋白表達水平較未轉染組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表 3。

表3 各組細胞中PI3K/AKT 信號通路相關蛋白表達水平（）

表3 各組細胞中PI3K/AKT 信號通路相關蛋白表達水平（）

注：與未轉染組比較，aP ＜ 0.05；與陰性組比較，bP ＜ 0.05

組別 PI3K AKT p-AKT CyclinD1 Bcl-2未轉染組 0.68 ± 0.04 0.81 ± 0.06 0.71 ± 0.05 0.86 ± 0.06 0.54 ± 0.03陰性組 0.65 ± 0.03 0.78 ± 0.05 0.73 ± 0.05 0.82 ± 0.05 0.53 ± 0.03干擾組 0.35 ± 0.02ab 0.76 ± 0.05 0.39 ± 0.03ab 0.43 ± 0.03ab 0.37 ± 0.02ab F 值 310.034 1.988 166.576 217.671 111.682 P 值 ＜0.001 0.159 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

LncRNA 是一類長度大于200 個核苷酸且不具備編碼蛋白質功能的RNA， 可與蛋白質、DNA和RNA 等結合在轉錄后水平、遺傳水平和轉錄水平3 個層面上廣泛參與胚胎發(fā)育、細胞增殖和凋亡等生物學過程，與包括胃癌在內的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。胃癌中存在異常表達的lncRNAs，而部分lncRNAs 不僅可作為腫瘤早期診斷和預后判斷的重要標志物， 還可作為基因治療的重要靶點，故深入探討lncRNA 在胃癌中的作用機制對胃癌的治療具有重要意義。

PlncRNA-1 是一個與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的 lncRNA。 Dong 等［7］研究指出，PlncRNA-1 在肝癌中呈現(xiàn)高表達， 且其表達水平與患者腫瘤大小、TNM 分期和血管侵犯程度有關； 體外細胞功能實驗發(fā)現(xiàn)，PlncRNA-1 表達下調可通過減弱上皮間質轉化進程抑制肝癌細胞增殖、侵襲和遷移，被認為可能是肝癌潛在的治療靶點。 Jia 等［8］報道指出，PlncRNA-1 在結直腸癌組織和細胞中表達上調，可通過調控miR-204 激活Wnt/β-肌動蛋白通路促進細胞周期進程、增殖和轉移并抑制細胞凋亡。 可見，PlncRNA-1 在肝癌和結直腸癌中發(fā)揮致癌作用。Baratieh 等［2］研究指出，PlncRNA-1 在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達，但其具體的作用機制并不清楚。本研究在胃癌SGC-7901 細胞中發(fā)現(xiàn)PlncRNA-1 表達升高，而轉染PlncRNA-1-siRNA 成功下調PlncRNA-1表達后發(fā)現(xiàn)，SGC-7901 細胞增殖活力明顯減弱，細胞在G0/G1期所占百分比和細胞凋亡率明顯升高。 結果表明，下調PlncRNA-1 表達可抑制SGC-7901 細胞增殖并誘導細胞周期阻滯與凋亡。 提示，PlncRNA-1 可能通過影響腫瘤細胞生物學行為在胃癌中發(fā)揮著重要的促癌作用。

PI3K/AKT 信號通路是細胞內一條重要的信號轉導通路，AKT 是PI3K 下游靶分子之一，也是該通路的核心因子，其可通過磷酸化作用被激活，影響其下游與增殖和凋亡密切相關的分子如CyclinD1、Bcl-2 等表達，進而調控細胞增殖和凋亡等生物學過程，與胃癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系［6，9］。 楊菁等［10］和 陳 龍云等［11］研 究 指 出 ，PI3K/AKT 信 號 通 路的激活可促進胃癌細胞增殖并抑制其凋亡，而阻斷其活化可抑制胃癌細胞生長。 Song 等［12］研究指出，PlncRNA-1 促進結直腸癌進展的分子機制與其激活PI3K/AKT 信號通路有關。 本研究在PlncRNA-1低表達的SGC-7901 細胞中發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 信號通路相關因子 PI3K、p-AKT、CyclinD1 和 Bcl-2 蛋白表達水平明顯降低。 結果表明，下調PlncRNA-1 表達可抑制SGC-7901 細胞中PI3K/AKT 信號通路激活。提示，在胃癌中PlncRNA-1 可能通過激活PI3K/AKT 信號通路上調促增殖蛋白CyclinD1 和抑凋亡蛋白Bcl-2 表達影響腫瘤細胞增殖和凋亡進而發(fā)揮致癌作用。

綜上所述，PlncRNA-1 在胃癌SGC-7901 細胞中表達升高， 干擾其表達可抑制SGC-7901 細胞增殖并誘導細胞周期阻滯和凋亡，其作用機制與抑制PI3K/AKT 信號通路的活化有關。 此外，前期背景資料查詢過程中，發(fā)現(xiàn)該基因雖然在多種腫瘤中高表達，發(fā)揮促癌基因的作用，但是統(tǒng)計文章作者所屬地區(qū)后發(fā)現(xiàn)，均是亞洲人，且主要以中國人為主，而歐洲和北美地區(qū)尚未見到類似研究，提示該基因的功能尚處于初步研究階段，而中國人關于該基因的研究尚處于領先階段；但是另一方面，也反映了關于該分子的研究證據(jù)等級較低。 后續(xù)還需在更多胃癌細胞系和體內動物實驗中進一步探索和研究PlncRNA-1 在胃癌發(fā)病機制中的作用，以期為胃癌發(fā)病機制及治療提供新線索。