陳建軍 趙怡迪 曹香林

（1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007；2. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007）

鯉是中國最重要的淡水魚之一，營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美［1］。在水質(zhì)惡化、飼料變質(zhì)等情況下，以鯉為代表的吃食性魚類易引發(fā)細(xì)菌性腸道疾病，從而阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［2-3］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分，因其是革蘭氏陰性細(xì)菌的主要毒力因子，常用于致病機(jī)制的研究［4］。腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IEC）是腸道內(nèi)外環(huán)境的媒介，又是機(jī)體免疫屏障的重要組成部分［5］。在開展環(huán)境細(xì)菌對魚類腸道毒理學(xué)機(jī)理研究中，采用活體暴露方式，往往由于實驗動物的個體差異，造成誤差和不確切的結(jié)果［6］。因此，采用鯉腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，利用離體細(xì)胞開展機(jī)理研究更為 理想［7］。

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)作為一種高效、快捷的轉(zhuǎn)錄組研究方法［8］，能夠反映細(xì)胞在某一特定環(huán)境和時間的基因表達(dá)情況，通過差異基因的表達(dá)分析和功能富集分析，挖掘功能基因［9］。呂鈞惠等通過RNA-seq技術(shù)分析研究中國青鳉原代肝細(xì)胞中雌激素響應(yīng)基因，并篩選出了105個顯著差異基因（37個上調(diào)，68個下調(diào)）［10］。岳影星等［11］采用RNA-seq技術(shù)對脂多糖處理大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，GO和KEGG富集的結(jié)果表明，上調(diào)基因與內(nèi)皮細(xì)胞對炎性免疫細(xì)胞的趨化作用和黏附作用密切相關(guān)；而下調(diào)基因則是與鈣離子信號和G蛋白相關(guān)通路以及內(nèi)皮通透性增加有關(guān)。

本研究以鯉腸上皮細(xì)胞為實驗對象，經(jīng)脂多糖暴露24 h后，利用RNA-seq技術(shù)獲得轉(zhuǎn)錄本后，通過差異基因的表達(dá)分析和功能富集分析，揭示脂多糖調(diào)控鯉腸上皮細(xì)胞差異基因的功能和通路。并利用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）方法，驗證轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因結(jié)果的可靠性。此研究有助于全面深入了解細(xì)菌對鯉腸道疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為開展環(huán)境細(xì)菌的魚類毒理學(xué)研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鯉腸上皮細(xì)胞系IECs購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；LPS L7770購自美國Sigma公司；MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；0.25%含EDTA胰酶消化液和PBS緩沖液購自美國HyClone公司；青鏈霉素混合液、二甲基亞砜購自北京索萊寶公司；RNAiso Plus、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀(jì)公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，型號：HERAcell 240 i）；蒸汽滅菌鍋（TOMY公司，型號：KG-SX-500）；超微量分光光度計（Thermo公司，型號：NANODROP 2000）；超凈工作臺（北京亞太克隆儀器技術(shù)有限公司，型號：BCL-定制型）；超速低溫離心機(jī)（德國SiGMA公司，型號：3K30）；熒光定量PCR儀（羅氏生物科技公司，型號：LightCycler?96）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傳代與培養(yǎng) 鯉腸上皮細(xì)胞使用MEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時進(jìn)行1∶2傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的鯉腸上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)以5×106個/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，對照組加入PBS緩沖液；脂多糖組加入LPS溶液使其終濃度為100 μg/mL（LPS溶液由PBS緩沖液配制）；每組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，于28℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h采樣。

1.2.2 RNA提取與文庫構(gòu)建 使用RNAiso Plus試劑對不同處理組的細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，使用超微量分光光度計和安捷倫2100生物分析儀對總RNA的濃度、質(zhì)量和完整性進(jìn)行檢測；檢測合格的RNA樣品構(gòu)建測序文庫，在上海歐易高通量測序平臺Illumina Hiseq進(jìn)行測序，獲得Clean Reads數(shù)據(jù)。

1.2.3 基因注釋與數(shù)據(jù)分析 利用hisat2將樣本數(shù)據(jù)（Clean Reads）與鯉的參考基因組進(jìn)行序列比對，用基因組注釋文件對所獲得的序列進(jìn)行基因注釋［12］。利用FPKM法計算基因表達(dá)量，設(shè)定參數(shù)（|log2fold change|＞1且q-value＜0.05）篩 選 差異表達(dá)基因［13-14］。采用Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因分別進(jìn)行GO和Pathway富集分析［15-16］。

1.2.4 qRT-PCR驗證差異基因 隨機(jī)選取10個DEG，利用Oligo 7.0設(shè)計引物進(jìn)行qRT-PCR以驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性（引物列表見表1）。具體的方法首先用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA，將RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以獲得cDNA為模板、β-actin為內(nèi)參基因，采用LightCycler?96熒光定量PCR儀器進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，45個循環(huán)；溶解曲線條件為：95℃ 15 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；冷卻：37℃ 30 s。每個樣品設(shè)置 3 次重復(fù)，采用2-△△CT計算各實驗組差異基因的表達(dá)量及變化倍數(shù)（FoldChange），并對FoldChange值進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS16.0 軟件通過單因素方差分析（one-way ANOVA）分析對照組和脂多糖組之間的差異。與對照相比，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

轉(zhuǎn)錄組分析共計6個樣本，包括對照組樣本：CON_1、CON_2、CON_3；和脂多糖組樣本：LPS_1、LPS_2、LPS_3。對照組和脂多糖組樣品得到原始測序序列（Raw reads）均高于50.14M條，進(jìn)一步對含有接頭及低質(zhì)量的Reads過濾得到Clean reads用于后續(xù)分析，共得到44.77G的Clean Data，GC含量46.50%-46.91%，Q30大于93.88%，其中，近81.83%的序列能夠比對到參考基因組（表2）。此結(jié)果說明本次測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于后續(xù)進(jìn)一步生物信息學(xué)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量分析Table 2 Quality analysis of transcriptome data

2.2 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

按照DEG篩選標(biāo)準(zhǔn)（P＜0.05且Fold Change＞2），綜合CON和LPS樣本基因表達(dá)分析共篩選出590個DEGs，上調(diào)和下調(diào)分別有303個和287個（圖1）。通過繪制火山圖可以了解差異表達(dá)基因的整體分布情況，灰色為非顯著性差異的基因，紅色為顯著性上調(diào)差異基因，綠色為顯著性下調(diào)差異基因。

圖1 差異表達(dá)基因統(tǒng)計柱狀圖及火山圖Fig. 1 Statistical histogram of differentially expressed genes and volcano map

2.3 GO富集分析

GO分析表明，共有1 752個基因得到歸類注釋，涉及生物學(xué)過程（biological processes）、細(xì)胞組分（cellular components）及分子功能（molecular function）3大類，共59個亞類（圖2）。在生物過程中共涉及23個亞類，DEG顯著富集于細(xì)胞過程（cellular process）類別、其次為單有機(jī)體過程類別（single-organism process）及代謝過程類別（metabolic process）。在細(xì)胞組成中共涉及16個亞類，DEG顯著富集于細(xì)胞（cell）、其次為細(xì)胞部分類別（cell part）及細(xì)胞器類別（organelle）。在分子功能共涉及20個亞類，結(jié)合功能類別（binding）DEG富集最多，其次催化活性功能類別（catalytic activity）及傳感器活性功能類別（transducer activity）。上述GO功能富集分析表明，脂多糖參與調(diào)控鯉腸上皮細(xì)胞的生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能。

圖2 差異表達(dá)基因GO分類Fig. 2 GO classification of differentially expressed genes

2.4 KEGG途徑分析

KEGG途徑分析表明，DEG被注釋到106條通路途徑中，其中KEGG富集的前20個途徑，如圖3氣泡圖所示。氣泡越大的條目包含的差異蛋白編碼基因數(shù)目越多，其富集P value值越小，顯著程度越大。通過 KEGG分析表明，差異表達(dá)基因顯著富集到細(xì)胞周期（cell cycle path：ccar04110）、自噬（autophagy path：ccar04140）、 凋 亡（apoptosis path：ccar04210）、mTOR信號通路（mTOR signaling pathway path：ccar04150）、P53信號通路（p53 signaling pathway path：ccar04115）、DNA復(fù)制（DNA replication path：ccar03030）、嘧啶代謝（pyrimidine metabolism path：ccar00240）、錯配修復(fù)（mismatch repair path：ccar03430）、堿基切除修復(fù)（base excision repair path：ccar03410）、核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair path：ccar03420）等10個信號通路。我們發(fā)現(xiàn)脂多糖主要誘導(dǎo)鯉腸上皮細(xì)胞周期、自噬、凋亡通路途徑。

圖3 差異基因顯著富集的前20條KEGG信號通路Fig. 3 Top 20 KEGG signaling pathways with significant enrichment of different genes

2.5 自噬、凋亡、細(xì)胞周期的差異表達(dá)基因分析

KEGG代謝途徑中與自噬、凋亡、細(xì)胞周期途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因，如表3所示。其中上調(diào)差異表達(dá)基因主要顯著富集到自噬、凋亡；下調(diào)差異表達(dá)基因主要顯著富集到細(xì)胞周期。轉(zhuǎn)錄組中注釋到自噬途徑中的LC3、BNIP3、ULK1、TP53INP2、LAMP、ATG16基因被誘導(dǎo)上調(diào)；轉(zhuǎn)錄組中注釋到凋亡途徑中的Casp9、Cathepsin、Gadd45、AP-1等基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，Lamin及PARP基因被誘導(dǎo)下調(diào)。此外，Gadd45基因在細(xì)胞周期途徑中也被誘導(dǎo)上調(diào)；轉(zhuǎn)錄組中注釋到細(xì)胞周期途徑中PCNA、Cdc14、CycB、CDK2、MCM2、PLK1、TGF-β基因在脂多糖刺激過后顯著下調(diào)。結(jié)果顯示了LPS阻滯了鯉腸上皮細(xì)胞周期，誘導(dǎo)自噬，引起細(xì)胞凋亡。

表3 自噬、凋亡、細(xì)胞周期的差異表達(dá)基因Table 3 Differentially expressed genes of autophagy，apoptosis and cell cycle

2.6 qRT-PCR 驗證基因表達(dá)

為驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是否準(zhǔn)確、可信，隨機(jī)選取10個差異基因進(jìn)行qRT-PCR檢測。結(jié)果表明qRTPCR測定結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果得到的差異基因表達(dá)變化趨勢一致（圖4），表明本研究中基于RNA-seq測序得到的數(shù)據(jù)是可信的。

圖4 qRT-PCR驗證RNA-seq測序的結(jié)果Fig. 4 qRT-PCR validates RNA-seq sequencing results

3 討論

腸道是魚類重要的免疫消化器官，腸上皮細(xì)胞作為體內(nèi)更新較快的一類細(xì)胞，在食物的消化、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、保護(hù)機(jī)體免受微生物感染等方面發(fā)揮重要作用［17-18］。脂多糖作為細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是革蘭陰性菌的主要毒力因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)損傷［19］。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，全面、快速地獲取脂多糖暴露于鯉腸上皮細(xì)胞過程中的所有轉(zhuǎn)錄本信息，系統(tǒng)地分析相關(guān)基因表達(dá)變化，為脂多糖調(diào)控的鯉腸上皮細(xì)胞分子機(jī)制提供理論依據(jù)。轉(zhuǎn)錄組測序共獲得44.77 G高質(zhì)量數(shù)據(jù)，其中，近81.83%的數(shù)據(jù)能夠比對到鯉基因組。利用DESeq軟件分析，與對照組相比，LPS處理可誘導(dǎo)差異表達(dá)基因590個，其中303個表達(dá)上調(diào)，287個表達(dá)下調(diào)。通過GO注釋分析發(fā)現(xiàn)，鯉腸上皮細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，在細(xì)胞過程、單一生物過程、代謝過程、細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器、結(jié)合和催化活性功能中發(fā)生了改變。KEGG 注釋分析發(fā)現(xiàn)，DEG顯著富集于細(xì)胞周期、自噬、凋亡等通路。注釋豐富的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將為進(jìn)一步分析脂多糖調(diào)控的鯉腸上皮細(xì)胞周期、自噬、凋亡通路基因提供重要的理論基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)脂多糖阻滯了鯉腸上皮細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程，而細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［20］。近年來的大量研究表明，Gadd45在DNA損傷時細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡中起了重要作用，維持著細(xì)胞基因組的的穩(wěn)定性［21］。Gadd45對G2/M期檢查點(diǎn)的調(diào)控主要是通過抑制Cyclin B/ CDK2復(fù)合物活性而實現(xiàn) 的［22-23］。DNA損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的Gadd45被轉(zhuǎn)運(yùn)入核后，解離Cyclin B/CDK2復(fù)合物，改變Cyclin B的亞細(xì)胞分布，使Cyclin B從核中輸出，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)被泛素介導(dǎo)降解［24］。這樣抑制了CDK2激酶的活性，并使細(xì)胞阻滯在G2/M轉(zhuǎn)變中［25］。細(xì)胞周期的每個階段都是被嚴(yán)格調(diào)控的，檢查點(diǎn)的存在是為了檢測潛在的DNA損傷，并允許在細(xì)胞分裂前修復(fù)［26］。如果損傷不能修復(fù)，細(xì)胞則會凋亡［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖通過誘導(dǎo)DNA損傷，增加Gadd45的表達(dá)從而抑制Cyclin B1/ CDK2復(fù)合物活性，阻滯鯉腸上皮細(xì)胞周期進(jìn)程。

與此同時，本研究還發(fā)現(xiàn)脂多糖可誘導(dǎo)鯉腸上皮細(xì)胞自噬，引起細(xì)胞凋亡。自噬，是一種溶酶體降解反應(yīng)，在饑餓和壓力等惡劣條件下，可通過降解細(xì)胞蛋白、細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)，從而維持細(xì)胞的新陳代謝［28］。許多研究表明，在外界壓力情況下，細(xì)胞通過BNIP3介導(dǎo)的自噬來對抗外界壓力，維持生存；自噬受多種信號通路的調(diào)控，如AMPK/mTOR等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，LC3在自噬信號通路中占有舉足輕重的地位［29-30］。其中LC3可在TP53INP2的幫助下，從細(xì)胞核移位至細(xì)胞質(zhì)完成脂質(zhì)化修飾，參與自噬體的生成［31］。我們的研究發(fā)現(xiàn)脂多糖可以通過激活mTOR信號通路，誘導(dǎo)BNIP3和TP53INP2的表達(dá)促進(jìn)LC3的轉(zhuǎn)化來誘導(dǎo)自噬。另外，自噬在細(xì)胞存活，特別是細(xì)胞凋亡信號通路中起著重要作用［32］。細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控，在正常細(xì)胞中，Caspase處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，Caspase被激活后發(fā)生凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞核（脫氧核糖核酸酶DNAse激活，PARP片段化），細(xì)胞骨架（lamin）和細(xì)胞代謝發(fā)生改變，發(fā)生不可逆的凋亡［33］。Lamin A/C和PARP是維持細(xì)胞正常功能和活力的基本核成分，有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性藥物誘發(fā)的凋亡與Lamin及PARP兩種核蛋白的降解呈正相關(guān)［34］。目前研究結(jié)果證明，脂多糖激活Caspase9，并且引起細(xì)胞凋亡和Lamin及PARP兩種核蛋白的降解。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一個突出的病理特征，慢性疾病常伴隨著許多細(xì)胞凋亡［35］。因此干預(yù)脂多糖誘導(dǎo)的鯉腸上皮細(xì)胞凋亡可能會延緩疾病進(jìn)展并降低腸道疾病的發(fā)病率。

4 結(jié)論

本研究利用RNA-seq技術(shù)與生物信息學(xué)相結(jié)合，闡明了脂多糖阻滯鯉腸上皮細(xì)胞周期、通過誘導(dǎo)自噬引起細(xì)胞凋亡等一系列的毒性效應(yīng)。本研究鑒定的DEG和信號傳導(dǎo)途徑將為研究和闡明養(yǎng)殖魚類中的細(xì)菌感染性腸道疾病提供重要的理論基礎(chǔ)。