王建勇 鄒永梅 葛言彬 王凱 席夢利

（1. 南京林業(yè)大學林學院，南京 210037；2. 福建農林大學海峽聯(lián)合研究院/農學院，福州 350002；3. 江蘇第二師范學院生命科學與化學 化工學院，南京 210013；4. 新疆瑪納斯縣平原林場，昌吉回族自治州 832206）

表觀遺傳是指染色質結構中可遺傳的改變，其不涉及DNA序列的變化，但深刻地影響基因表達和細胞功能。近年來，表觀遺傳學的研究進展，正不斷刷新我們對生命現(xiàn)象的認識。已有研究表明，染色質狀態(tài)的改變在控制細胞分化和脫分化中發(fā)揮重要作用［1］。植物組織培養(yǎng)正是利用細胞可以脫分化和再分化的特性，進行植物的快速繁殖及重要代謝產物的生產。其中植物細胞脫分化形成愈傷組織是組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。愈傷組織是離體培養(yǎng)時，植物組織或器官中已分化的細胞，在外源激素的刺激下改變了原有的細胞命運，經細胞脫分化和不斷增殖所形成的無特定結構、無明顯極性的松散組織。愈傷組織的獲得一般是將成熟的體細胞“逆轉”到分化程度較低的狀態(tài)并恢復其增殖能力［2］。在逆轉過程中，大量的表觀遺傳修飾參與其中［1，3-8］。表觀遺傳修飾一般會引起染色質結構的改變，并伴隨基因表達水平的變化。在動物方面，分化的細胞染色質呈現(xiàn)閉合狀態(tài)，基因表達穩(wěn)定，而未分化細胞的染色質處于開放狀態(tài)，基因表達會發(fā)生動態(tài)的變化。表觀遺傳修飾參與到動物細胞從分化狀態(tài)轉變?yōu)槊摲只癄顟B(tài)的過程中，將染色質從閉合狀態(tài)打開，結合調控因子，通過不同途徑，影響下游基因的表達。在植物方面，雖然在玉米［9］，擬南芥［10］，小麥［11］和甜菜［12］中均已證實表觀遺傳通過改變基因表達和染色質結構影響植物細胞的命運轉變，調控愈傷組織的形成，但是具體的表觀修飾方式還沒有統(tǒng)一的定論。本文綜述了植物愈傷組織誘導過程中DNA甲基化，組蛋白修飾，小RNA及染色質重塑等常見表觀遺傳修飾的研究進展，總結了存在的問題并提出了植物愈傷組織誘導過程中表觀遺傳學研究的方向。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是DNA化學修飾的一種，是真核生物中研究最深入的表觀遺傳標記。指在不改變DNA序列的前提下，DNA甲基化轉移酶在胞嘧啶5'碳上通過共價結合的方式添加一個甲基基團形成5-甲基胞嘧啶［13-15］。常見類型可分為3種：CG、CHG和CHH（H = A，T或C）［16］。DNA甲基化可以提供超出植物基因組DNA序列以外的可遺傳信息，如果甲基化水平不足會導致植株生長發(fā)育的異常。因此，DNA甲基化在沉默有害轉座子插入，保護基因組穩(wěn)定性，調節(jié)不同發(fā)育階段和不同環(huán)境條件下的基因表達等方面發(fā)揮著重要作用［15，17］。

在植物的整個生長發(fā)育過程中，不同的時期，不同的發(fā)育階段會伴隨著特定基因的轉錄表達。植物DNA甲基化水平的改變在調控基因的表達和沉默方面起到了重要作用?；蚣谆癄顟B(tài)一般分為3種類型：持家基因通常處于低甲基化狀態(tài)或者不被甲基化，從而保證基因的穩(wěn)定表達；誘導性基因則在不同發(fā)育階段、組織特異性基因表達和外界脅迫時，轉變?yōu)槿ゼ谆癄顟B(tài)；沉默基因通常處于高甲基化狀態(tài)。植物愈傷組織誘導期間會發(fā)生DNA甲基化水平的改變，這主要是因為植物細胞在外界植物激素的誘導下脫分化形成愈傷組織時需要DNA甲基化的全局重編程。愈傷組織形成期間的甲基變化以DNA低甲基化事件為主，但局部DNA，尤其是部分器官決定基因常常需要超甲基化以刺激愈傷組織的形成，但物種之間存在顯著差異［12，18-19］。

1.1 甲基轉移酶與DNA甲基化

愈傷組織誘導過程需要抑制器官發(fā)生基因的表達，促進愈傷組織的形成，因此需要將這些基因的啟動子區(qū)或編碼區(qū)進行重新甲基化，使得器官發(fā)生基因表達沉默。植物體內甲基轉移酶（methyltransferase1，MET1）主要維持基因組中重復及單拷貝序列CG位點的甲基化。MET1參與RNA介導的DNA甲基化（RdDM）途徑，在MET1的作用下引起基因位點的甲基化。MET1的突變會導致部分基因的啟動子區(qū)域去甲基化，使得該區(qū)域的染色質結構發(fā)生改變，對DNaseI 敏感性增強，有利于反式作用因子的結合，進一步活化基因，促進轉錄表達。Berdasco等［20］對野生型擬南芥和met1突變體葉片和根愈傷組織誘導過程中甲基化水平變化進行研究發(fā)現(xiàn)，在met1突變體誘導的愈傷組織中，篩選出505個差異表達基因，其中GLUTATHIONE S-TRANSFERASE TAU 10（GSTU10）、MITOGEN- ACTIVATEDPROTEINKINASE 12（MAPK12）、BETAXYLOSIDASE 1（BXL1）和WUSCHEL（WUS）等器官發(fā)生基因啟動子區(qū)域的甲基化水平與野生型相比急劇下降，并伴隨較低的愈傷誘導能力。Li等［21］也得到了相同的結果，在擬南芥met1突變體中，WUS啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平的下降引起WUS基因表達的上調，從而造成愈傷組織誘導能力的下降。

1.2 DNA序列差異影響甲基化程度

植物基因組中不同DNA序列的甲基化敏感性不同，造成了異染色質區(qū)域如著絲粒區(qū)域、核糖體RNA編碼序列、轉座子的序列更容易被甲基化。轉座子作為一種DNA重復序列很容易發(fā)生甲基化的改變。組織培養(yǎng)作為一種外界脅迫，會招募轉座子富集到基因附近的區(qū)域，進而發(fā)生超甲基化現(xiàn)象，引起基因表達沉默。Stelpflug等［22］在篩選玉米幼胚和愈傷組織之間的差異甲基化區(qū)域時發(fā)現(xiàn)，低甲基化主要富集在不含轉座子的區(qū)域，促進愈傷組織發(fā)育特異性基因的表達，而未擴散的LTR附近呈現(xiàn)超甲基化現(xiàn)象，抑制附近基因的表達。Gozukirmizi等［23］將大麥成熟胚置于添加4 mg/L麥草畏的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，相對于4 d的幼苗，LTR轉座子在誘導15 d和30 d的愈傷組織中出現(xiàn)超甲基化的現(xiàn)象。

基因在總基因組中僅占據(jù)一小部分，非編碼DNA會影響基因的精確調控以及干擾基因的轉錄。DNA甲基化作為一種有效機制可以長期沉默非編碼DNA，調控基因的表達。前期的研究成果表明：在組織培養(yǎng)過程中甲基化的丟失要多于甲基化的獲得，且DNA甲基化的這種改變主要發(fā)生在愈傷組織誘導的前期，植物激素作為一種誘導因子，誘導相關基因的去甲基化，促進愈傷組織發(fā)育特異性基因的表達來應對外界環(huán)境的變化。雖然甲基轉移酶與DNA序列差異都會影響甲基化水平，但還有很多因素如培養(yǎng)方式的差異也會影響不同的甲基化模式，因此在未來的研究工作中需要更加深入地探討愈傷組織誘導過程中DNA甲基化的分子機制。

2 組蛋白修飾

組蛋白修飾是在核小體的組蛋白N尾上發(fā)生的化學修飾，包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化和小泛素相關修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）等。與DNA甲基化這種穩(wěn)定的表觀修飾相比，組蛋白修飾具有更好的可塑性。組蛋白修飾能夠影響染色質結構，控制DNA的可及性，調節(jié)轉錄活性，并可遺傳給子細胞，在植物發(fā)育的各個階段均發(fā)揮重要作用［24-29］。

組蛋白修飾主要發(fā)生在基因的轉錄起始區(qū)和基因本身，以調節(jié)基因的表達。與已分化的體細胞相比，在脫分化的愈傷組織細胞中，激活性組蛋白修 飾 如H3K4me3、H3K36me3、H3ac和H2Aub顯著富集，而抑制性組蛋白修飾如H3K9me2/me3和H3K27me2/me3明顯減少［30］。

2.1 組蛋白乙?；揎棿龠M愈傷組織形成

組蛋白乙?；揎椫饕揽拷M蛋白乙?；D移酶和組蛋白脫乙?；腹餐S持動態(tài)平衡。組蛋白乙?；揎椀母淖円话銜绊懼参镩_花、胚胎發(fā)育和愈傷組織誘導。其作用機制主要是促進正電荷中和，增大與DNA之間的排斥力，誘導部分染色質呈現(xiàn)開放狀態(tài)，促進轉錄因子的結合，提高基因的表達水平。前期研究工作表明，在植物愈傷組織誘導過程中組蛋白乙?；纳险{表達有助于愈傷組織的形成。Lee、Xu和Furuta等［7-8，31-32］將擬南芥葉片置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，組蛋白脫乙酰基因HISTONE DEACETYLASE9（HDA9）在培養(yǎng)96 h后開始上調表達，激活生長素途徑基因LATERAL ORGAN BOUNDARIES-DOMAIN 17（LBD17），LEAFYCOTYLEDON 1（LEC1），伴隨APETALA（AP2），NAM/ATAF1/CUC2（NAC）和BASIC/HELIX-LOOP -HELIX（bHLH）等轉錄因子家族基因不同程度的表達，進而觸發(fā)組蛋白的脫乙?；?，引起細胞狀態(tài)的動態(tài)變化，從而使細胞恢復分裂能力，形成愈傷組織。而hda9-1突變體細胞脫分化的能力明顯下降，其愈傷組織鮮重與野生型相比下降約30%，也說明了HDA9在促進愈傷組織形成中的重要作用。Zhang等［33］發(fā)現(xiàn)將水稻hda710突變體與中華11號的成熟合子胚置于誘導培養(yǎng)基上18 d后，相對于中華11號，hda710的愈傷組織形成明顯受阻，細胞團更小，愈傷組織鮮重降低50%。

2.2 組蛋白去甲基化促進愈傷組織形成

組蛋白甲基化主要發(fā)生在H3、H4組蛋白的氨基酸殘基上，主要是增加氨基酸殘基之間的疏水作用力。組蛋白甲基化對基因表達的影響主要依賴于被修飾的位置，如激活性組蛋白修飾H3K4me3和H3K36me3，抑制性組蛋白修飾H3K9me2/me3和H3K27me2/me3。愈傷組織的形成需要經歷細胞命運的轉變，在這個過程中大量的組蛋白修飾因子參與其中以調控細胞周期、染色質結構和DNA合成的相關基因上調表達進而促進愈傷組織的形成［31，34］。已有文獻報道，擬南芥葉片向愈傷組織轉變過程中需要先將組蛋白甲基化，抑制葉的身份特性，隨后通過組蛋白的脫甲基化激活根的身份特性，促進愈傷組織的形成。Jumonji C domain-containing 30（JMJ30）蛋白是一種組蛋白去甲基化酶。JMJ30結合Auxin response factor 7（ARF7） 和ARF19形 成ARFJMJ30，并招募RABIDOPSIS TRITHORAX-RELATED 2（ATXR2）形成復合物，靶定LATERAL ORGAN BOUNDARIES -DOMAIN 16（LBD16）和LBD29基因啟動子區(qū)域，抑制H3K9me3，激活H3K36me3，使LBD基因上調，提高細胞分裂活性，加速擬南芥葉片向愈傷組織的轉變（圖1）。Lee等［35］發(fā)現(xiàn)擬南芥jmj30-2突變體愈傷組織的鮮重與野生型相比下降15%。這些結果說明了組蛋白修飾影響了基因的表達，并調控愈傷組織的形成。LYSINE-SPECIFIC DEMETHYLASE 1-LIKE3（LDL3）通過特異性消除H3K4me2，影響下游基因的表達。LDL3在生長區(qū)域高表達以促進愈傷組織的形成。Ishihara等［36］將擬南芥ldl3-1和ldl3-2突變體幼苗的根置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，H3K4me2特異性增加，愈傷組織形成能力顯著下降。

圖1 JMJ30 介導的組蛋白去甲基化模式圖［35］Fig.1 JMJ30-mediated demethylation of histone in callus formation［35］

2.3 組蛋白甲基化影響端粒長度

端粒作為染色體末端的DNA序列，對于維持植物染色體的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用。動物中一般認為端粒長度會隨著細胞分化而變短，但是在植物中這種情況并不相同。通常情況下，植物體細胞分化和衰老都會伴隨端粒長度的變化，端粒長度的改變會引起植物發(fā)育異常和染色體融合頻率的改變。

植物愈傷組織誘導伴隨著細胞的脫分化，細胞的分裂過程中染色體的復制必然需要合成新的端粒。端粒長度的維持是一個非常復雜的過程，不僅有基因的參與，還有表觀遺傳修飾因子的影響。植物愈傷組織誘導過程中組蛋白修飾不僅影響基因的表達情況，還有可能影響端粒的長度［37-38］。Grafi和 Sováková等［38-39］在Columbia（Col）、Landsberg erecta（Ler）和Wassilevskija（Ws）3種生態(tài)型的擬南芥葉片愈傷組織誘導和繼代培養(yǎng)期間，觀測到H3K9me2、H3K4me3、H3K4me2和H3K27me3信號的強度發(fā)生改變，同時還發(fā)現(xiàn)愈傷組織的端粒長度與葉片中的相比發(fā)生了一定程度的增加，但兩者之間的內在關系尚不清楚。有一種解釋是，H3K9組蛋白甲基轉移酶SUVH4/KYP 在植物愈傷組織誘導和端粒長度改變的過程中扮演重要角色。雖然SUVH4/KYP可以影響到端粒長度的改變，但是SUVH4/KYP并不直接控制端粒的長度變化，而是可能依賴于端粒替代性延長（alterative lengthening of telomere，ALT）機制。首先，SUVH4/KYP組蛋白甲基化轉移酶對H3K9進行從頭甲基化，并激活泛素蛋白水解途徑中的相關基因；然后，誘導端粒區(qū)域的DNA進行重組，使得端粒長度增加；最后，較長的端粒有利于細胞重新進入細胞周期，促進細胞分裂，引起細胞脫分化形成愈傷組織［38-39］。雖然這種解釋可以解析擬南芥中組蛋白修飾的改變與端粒長度之間的關系，但是值得注意的是這種現(xiàn)象并不具有普遍性，Gallego 和Fajkus等［40-41］在煙草葉片誘導愈傷組織的過程中并沒有發(fā)現(xiàn)端粒長度的變化。因此兩者之間并不是存在唯一的分子機制，還有其他的分子機制或影響因素需要進一步研究。

綜合上述研究成果可知，表觀修飾是細胞命運轉變的基礎，而組蛋白修飾在細胞命運轉變過程中并不是單獨起作用，需要與其他因子相互作用，逐步地精細調控相關基因表達以促進愈傷組織的形成，因此對于組蛋白修飾調控愈傷組織的形成需要從更多角度進行研究。

3 小RNA

小RNA（small RNAs）是指一類在植物中高度保守，長度在21-24 nt的單鏈RNA，通常調控基因轉錄后的表達，主要分為兩類：microRNAs（miRNAs）和 small interfering RNAs（siRNAs）［42-44］。小RNA作為基因表達的負調控因子，廣泛分布在植物基因組中，對調節(jié)植物生長發(fā)育、信號轉導和脅迫響應等方面發(fā)揮關鍵作用。

3.1 小RNA調控DNA甲基化促進愈傷組織形成

小RNA可以通過DNA甲基化和染色質修飾介導轉錄沉默，以調控基因的表達，進而促進愈傷組織的形成。Liu等［45］研究發(fā)現(xiàn)玉米幼胚誘導愈傷組織過程中，基因啟動子區(qū)域的甲基化水平增加，基因表達出現(xiàn)下調現(xiàn)象。同時還發(fā)現(xiàn)21 nt和22 nt小RNAs與甲基化水平存在較弱的相關性，而24 nt小RNA與DNA甲基化水平在愈傷組織中呈現(xiàn)正相關，而與對照組未誘導的幼胚中的DNA甲基化水平呈負相關。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與24 nt小RNA參與RNA介導的DNA甲基化途徑有關?；蚪M上的重復序列通過RNA Pol II轉錄生成初級的前體mRNA，前體mRNA在Dicer-like 3的作用下進行剪接加工。U2 snRNP輔助因子（U2 snRNP auxiliary factor，U2AF）作為參與前體mRNA剪接的重要輔助因子，可以識別內含子富含U或UA的序列，實現(xiàn)前體mRNA的剪接。24 nt RNA可以通過靶定下游U2AF亞基引起可變剪接，利用甲基轉移酶domains rearranged methyltransferase 2（DRM2）對其基因組序列進行甲基化修飾。DNA甲基化會導致基因的沉默，促進愈傷組織的形成。

3.2 小RNA通過影響激素信號途徑調控愈傷組織形成

激素能參與植物不同的發(fā)育過程，如細胞分裂、器官形成和脅迫反應等不同的發(fā)育過程，小RNA可以通過靶定不同的基因協(xié)調激素應答途徑，調控植物的生長發(fā)育。小RNA不僅可以促進愈傷組織的形成，還會抑制植物愈傷組織的形成。小RNA受到植物激素的誘導，miRNA抑制靶基因的表達，而后者直接調控植物的發(fā)育。Liu和Qiao等［42，46］認為miR160可以與AUXIN RESPONSE FACTOR10（ARF10）互作，通過對ARF10的可變剪切，抑制ARF10表達。ARF10進一步結合生長素響應元件（AuxREs）的啟動子區(qū)域，影響生長素信號通路，抑制ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR 15（ARR15）表達，即miR160間接提高ARR15表達，影響生長素信號途徑，抑制愈傷組織形成。Liu等［42］將mARF10（miR160-resistant ARF10）突變體的下胚軸在轉入愈傷組織誘導培養(yǎng)基48 h后，相對于野生型的下胚軸外植體來說，mARF10的愈傷組織起始更快，然而愈傷組織起始慢于Pro35S：miR160c突變體。這說明miR160可以間接抑制愈傷組織的形成。Zhang等［47］認為miR156通過靶定SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE9（SPL9，一類保守的DNA結合蛋白），并與B-ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORs（ARRs）相互作用抑制細胞分裂素響應途徑，從而影響擬南芥根愈傷組織的形成。在愈傷組織誘導的初期miRNA156表達量突然下調，然后恢復到很高的水平，miRNA156可能負調控SPL9轉錄因子促進細胞脫分化，誘導愈傷組織的形成。這表明小RNA與細胞分裂素途徑在調控愈傷組織中密切相關。

上述研究表明小RNA對于愈傷組織的誘導多以間接形式進行調控，如miRNA可以通過調控激素信號途徑影響愈傷組織的形成。一種miRNA可以參加不同的激素信號途徑，且不同的信號途徑之間又具有相互作用，誘導細胞的脫分化。miRNA通過不同的途徑調控下游信號，不同途徑形成截然相反的作用。因此，未來的研究需要考慮到miRNA作用的多重性和交互性，繼續(xù)挖掘更多小RNA的有效功能，可為小RNA調控愈傷組織形成的研究提供參考依據(jù)。

4 染色質重塑

染色質重塑是植物細胞命運轉化過程中重編程的主要現(xiàn)象，涉及核小體的結構及其與DNA相對序列位置的改變，使組蛋白和DNA之間的結合狀態(tài)變?yōu)椤笆杷伞睜顟B(tài)，增加了基因啟動子區(qū)序列的可接近性，使反式作用因子如轉錄因子與之結合并啟動基因轉錄，調節(jié)基因的表達［48］。

4.1 染色質重塑影響基因表達

染色質結構的改變可引起植物表型的改變，參與染色質結構和功能改變的因素相互作用，構成了染色質結構動態(tài)、隨機和不確定性的變化，這種變化可以引起DNA可及性的改變，通過招募轉錄因子調控基因的表達。染色質重塑可以通過調節(jié)染色質的結構來影響基因的表達，因此染色質結構的重塑對于植物細胞的脫分化至關重要。Polycomb group（PcG）可以通過修飾染色質以抑制特定分化狀態(tài)下基因的表達。Polycomb repressive complex 1（PRC1）和PRC2是PcG中兩類重要的表觀遺傳修飾復合體，一般認為它們能催化抑制性組蛋白修飾H3K27me3的形成從而抑制基因表達，維持植物細胞的分化狀態(tài)。Lee等［8］發(fā)現(xiàn)擬南芥PRC1或PRC2的 突 變 會 使LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）、LEC2、AGAMOUS-LIKE 15（AGL15）、BABY BOOM（BBM）、WUSCHEL（WUS）和WUSCHEL RELATED HOMEOBOX 5（WOX5）異位表達使根自發(fā)形成愈傷組織。這說明了PcG可以調控H3K27me3修飾影響愈傷組織的形成。

4.2 染色質重塑影響細胞命運轉變

染色質重塑可以通過抑制染色質的重新組裝影響愈傷組織的形成。細胞可塑性是分化細胞獲得新命運的能力。其中，脫分化形成愈傷組織就是一種細胞可塑性的表現(xiàn)形式，脫分化過程可分兩個階段：細胞極性的獲得和重新進入S期。主要表現(xiàn)在分化細胞從G1期向S期的轉變，該過程需要具有新命運細胞遺傳物質的合成，為脫分化的細胞增殖做準備。異染色質蛋白1（heterochromatin protein 1，HP1）是異染色質的特征性蛋白，最初從果蠅多線染色體異染色質中被分離出來。組蛋白H3K9甲基化可以使HP1重新分布，抑制染色質的重新組裝，誘導基因的沉默，引起分化細胞命運的轉變［49］。Williams等［49］在研究擬南芥葉片原生質體誘導形成愈傷組織的過程中，發(fā)現(xiàn)異染色質區(qū)的HP1蛋白與retinoblastoma protein（pRb）結合，招募常染色質E2F的靶基因RIBONUCLEOTID REDUCTASE2（RNR2） 和PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN（PCNA），形成pRb/E2F靶基因的復合體，使E2F的靶基因上調表達，在激素處理72 h后促使細胞進入S期，引起細胞分裂增殖，從而誘導愈傷組織的形成。

分化細胞向全能性干細胞的命運轉變在細胞生物學領域依然是一個研究熱點。染色質重塑通過調控下游細胞周期調控基因的表達，最終影響植物細胞命運的轉變。染色質重塑與細胞周期調控都有助于愈傷組織的形成，因此染色質重塑與細胞周期調控的結合研究有助于我們更好地理解植物愈傷組織形成的具體機制。

5 轉座子

轉座子又稱跳躍基因，是一類可以移動的遺傳因子，指基因組中可以改變位置的DNA序列。最早是由科學家芭芭拉·麥克林托克在研究玉米籽粒顏色變化中發(fā)現(xiàn)，并提出了著名的“Ac-Ds調控系統(tǒng)”。植物轉座子主要分布在著絲粒和基因密集區(qū)，具有種類多，數(shù)量大的特點。通常可分為：I型轉座子、II型轉座子及Helitron轉座子［12］。雖然轉座子數(shù)量龐大，但只有少數(shù)轉座子可以表達。轉座子作為表觀遺傳調控的重要靶位點，影響基因的表達，在調控生長發(fā)育、應對環(huán)境變化和細胞命運轉變等過程中發(fā)揮重要的作用。

5.1 轉座子甲基化調控愈傷組織形成

在細胞發(fā)育過程中，愈傷組織誘導伴隨著細胞命運的轉變，細胞重新進入細胞周期。重新進入細胞周期需要合成大量的遺傳物質，雖然遺傳信息的穩(wěn)定表達是至關重要的，但是具有活性的轉座子在基因組間的跳躍常常影響基因的表達，如轉座子插入到基因內部，則會引起基因的失活；當轉座子插入到調控區(qū)，則會影響基因的表達。為了維持DNA復制的穩(wěn)定性，對一些轉座子進行失活，需要抑制性修飾如甲基化來維持遺傳信息的穩(wěn)定表達，當轉座子插入到基因上游，將甲基化的修飾延伸到臨近基因的調控區(qū)域，則會引起基因表達的下降。植物愈傷組織誘導過程中轉座子就常伴隨甲基化水平 的改變［12，50-55］。Zhang、Baucom、Wang和Lanciano等［56-59］在玉米愈傷組織誘導過程中，LTR轉座子發(fā)生甲基化的改變。這表明LTR類型的轉座子在玉米愈傷組織誘導過程中具有調控作用。但是在繼代培養(yǎng)中Copia呈現(xiàn)正調控作用，而Gypsy呈現(xiàn)負調控作用。在水稻中，Saze等［60］也發(fā)現(xiàn)Gypsy中的Tos17在愈傷組織誘導過程中隨著甲基化程度降低而逐漸被激活，并在繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象。這進一步說明由于LTR轉座子甲基化抑制的不足，會造成不同表觀遺傳調控現(xiàn)象。

5.2 DNA甲基化和組蛋白修飾共同調控轉座子 活性

DNA甲基化不僅可以單獨調控轉座子的表達，還可以與組蛋白修飾相互作用共同影響轉座子的活性。在擬南芥中，組蛋白脫乙?；窰DA6對于轉座子和胞嘧啶甲基化維持是必需的，HDA6通過調節(jié)組蛋白乙?；图谆约稗D座子的DNA甲基化狀態(tài)使轉座子沉默，有助于穩(wěn)定基因表達狀態(tài)。Lee等［30］認為DEFICIENT IN DNA METHYLATION 1（DDM1）、METHLTRANSFERASE 1（MET1） 和HISTONE DEACETYLASE 6（HDA6）三者形成蛋白復合體，通過調節(jié)組蛋白H3和H4的乙?；约敖M蛋白H3K4甲基化來保持轉座子沉默，從而促進愈傷組織的形成。

轉座子作為活躍的遺傳因子，在植物基因調控方面發(fā)揮重要作用。植物基因組中含有大量的轉座子元件，且種類豐富，在玉米等具有復雜基因組的植物中占比高達85%以上，轉座子在基因組中的擴增和向基因密集區(qū)的轉移為植物基因表達調控研究提供了廣闊的空間。前期的研究證明了愈傷組織誘導期間基因表達的變化需要轉座子的參與，但是需要在研究中充分考慮到不同類型的轉座子在植物愈傷組織誘導過程中發(fā)揮的作用，降低轉座子對細胞命運轉變的影響。

6 總結與展望

植物離體組織或器官在外源激素的刺激下發(fā)生細胞命運的轉變，即已經分化的成熟細胞逆轉成脫分化的多能性干細胞。在脫分化過程中伴隨著基因表達，染色質結構的改變，這些改變需要大量的表觀遺傳修飾參與其中，DNA甲基化，組蛋白修飾，小RNA，染色質重塑和轉座子以不同的方式和機制影響愈傷組織的形成。盡管表觀遺傳調控植物愈傷組織誘導已有不少研究報道，但該領域的研究還處于初級階段，筆者認為，以下4個方面還需進一步開展研究。

6.1 研究材料的局限性

植物愈傷組織誘導是植物組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，盡管多種植物已成功誘導出了愈傷組織，但是仍有大量植物材料（如頑拗植物）不能誘導出愈傷組織。即使在已經誘導出愈傷組織的材料中依然存在很多難題，如單子葉植物可以誘導愈傷組織的外植體部位有限，裸子植物誘導相對于被子植物更加困難。在可以成功誘導愈傷組織的植物中，表觀遺傳學研究主要集中在擬南芥、玉米和水稻等模式植物，對于其他非模式植物開展的相關研究卻非常有限。由于研究材料的類型不同，外植體的生理狀態(tài)及取材時間的差異，常常會得到不同的實驗結果。例如，全基因組范圍的H3K27me3積累對于擬南芥葉片誘導愈傷組織是必需的，但是這種修飾對于根作為外植體卻影響很?。?8］。因此，應廣泛開展不同植物及不同外植體在愈傷組織誘導過程中的表觀遺傳學研究，積累更多的實驗結果，為揭示植物愈傷組織誘導過程中的表觀遺傳學規(guī)律奠定基礎。

6.2 研究方法的局限性

表觀遺傳學的研究方法主要有chromatin Immunoprecipitation（ChIP），RNA binding protein Immunoprecipitation（RIP）和SmartFlare等。雖 然針對愈傷組織誘導過程有大量的表觀修飾的研究，但是研究方法依然存在很多的局限性：一是使用的抗體相對較單一，無法全面反映植物體內的表觀遺傳修飾；二是種類繁多的小RNA及轉座子的鑒定在很大程度上依賴于生物信息學的研究，對其功能研究卻相對滯后，無法得知在愈傷組織誘導過程中的具體功能，尤其是可能存在相反的調控結果；三是研究方法主要集中在探究一種類型的表觀遺傳修飾，并沒有將多個遺傳修飾結合起來研究。因此，未來研究需要結合下一代的測序技術，如染色質轉座酶可及性測序（assay for transponsase-accessible chromatin with high-throughput sequencing，ATACseq）、DNA親和純化測序（DNA affinity purification sequencing，DAP-seq）、單細胞技術和基因編輯技術等多種手段，并不斷改進現(xiàn)有的研究方法，整合多組學、跨學科的研究手段，探尋能夠全方面多維度反映植物愈傷組織誘導過程中的表觀調控機制。

6.3 理論知識的缺乏

隨著表觀遺傳研究的不斷深入，大量的表觀遺傳修飾被發(fā)掘，并應用到生物學研究中，但是應用到植物愈傷誘導研究的表觀遺傳修飾只有少數(shù)幾類，因此我們無法將現(xiàn)有零碎的知識整合起來全面地研究表觀修飾所反映的內在機制。另外，表觀遺傳因子可以聚集在一起，受到上游不同基因的調控，同時又調節(jié)眾多下游基因的表達，從而影響諸多的發(fā)育過程。這些復雜的信號通絡，構成了立體的空間網絡。目前的研究多集中在某個單一的信號通路上，對多種通路是否有相同的功能和多信號通路之間的相互作用探索不夠深入。在未來的研究中需要建全動態(tài)的復雜表觀調控網絡，深化表觀遺傳對愈傷組織調控的理論知識。

6.4 分子機制的薄弱

現(xiàn)有的研究多集中在愈傷組織誘導過程中總DNA甲基化水平的改變，對于單基因甲基化水平的改變及如何精細化調節(jié)基因表達依舊不明確；組蛋白修飾之間相互作用比較復雜。例如，H3ac與H3K27me3皆可以拮抗激活根發(fā)育基因PLTs，又能協(xié)同抑制LECs基因。因此，可能存在其他的機制調控兩者之間的關系；小RNA的研究主要集中在生長素和赤霉素方面，對于獨腳金內酯等新型激素的研究還是空白，同時由于小RNA主要以家族形式存在，目前研究中的小RNA轉基因材料只是表達水平下降，并不能真正反映小RNA的功能；植物體內多種染色質重塑復合體是如何特異性調節(jié)靶基因，以及如何與組蛋白修飾相互作用介導基因沉默的機制還有待研究；轉座子的激活和沉默機制還需要具體分析。

細胞的分化和脫分化是植物生長發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，愈傷組織作為分化細胞脫分化的產物，被廣泛應用到生物學研究的多個領域［61］。在植物愈傷組織誘導過程中，分化細胞與脫分化形成的愈傷組織細胞，非胚性愈傷組織向胚性愈傷組織的定向誘導，需要平衡分化和脫分化的關系，從遺傳和表觀遺傳協(xié)同的角度去理解并調控該發(fā)育過程。隨著人們對植物發(fā)育機制的深入解析，未來將可能設計更強大的分子工具，進行植物組織培養(yǎng)的“私人訂制”。