劉 潔，金科華

(1.湖北科技學院護理學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院基礎醫(yī)學院)

影響酶促反應的因素是一個重要的生化實驗，常利用唾液淀粉酶A(salivary amylase A,SAA)作為研究對象。不少實驗教程中均用唾液中的SAA[1-2]進行實驗，唾液中的SAA雖可達到實驗目的，但存在諸多弊端：①隨著非典、新冠等傳染病的流行，用唾液中的SAA存在感染疾病的風險；②唾液很粘稠，滴加唾液的量難以控制；③不同人的唾液淀粉酶含量差異大，加之收集唾液用水體積難以固定，以致實驗組間淀粉酶濃度差異大，結果可比性差；④學生用一次性紙杯收集唾液，紙杯用量大，廢棄的紙杯污染環(huán)境?；蚬こ躺a的重組SAA(rSAA)無病原微生物，師生無感染疾病的風險；rSAA溶于緩沖液中，分散性好，用量可精確控制；用rSAA進行實驗無需一次性紙杯，對環(huán)境無污染。筆者利用基因工程在大腸桿菌中表達了具有高活性的rSAA，簡化了實驗操作，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、HiFi DNA Polymerase、DNA Marker為北京全式金生物科技有限公司產品。pET-28a質粒由筆者保存。人SAA cDNA由廈門大學韓家淮教授饋贈。質粒抽提試劑盒、引物、SDS-PAGE相關試劑為生工生物工程公司產品。限制性內切酶、預染蛋白質Marker均為NEB公司產品。膠回收試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產品，DNA連接試劑盒為TaKaRa公司產品。其它試劑為國產分析純。

1.2 PCR擴增SAA cDNA

設計擴增SAA cDNA全長的正向引物F1和反向引物R1。F1序列為：5′GTCGGATCCATGAAGCTCTTTTGGTTGCTTTTC 3′;R1序列為：5′CTGCTCGAGTTACAATTTAGATTCAGCATGAATTG 3′。F1和R1序列中斜體部分為保護堿基，下劃線部分依次為BamH I、Xho I位點。PCR體系為：F1(10μmol/L)1μL，R1(10μmol/L)1μL，10×HiFi Buffer I 5μL，dNTP Mixture(10mmol/L each)1μL，H2O 31.5μL，HiFi DNA polymerase 0.5μL，SAA cDNA 10μL。反應參數(shù)：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s,72℃延伸1.5min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。

1.3 PCR產物和質粒雙酶切、連接與轉化

PCR產物全部用于電泳，膠回收后用35μL洗脫液緩沖液洗脫?；厥债a物酶切：PCR產物20μL，H2O 30μL，10×Cut Smart Buffer 6μL，BamH I和Xho I各2μL，混勻，37℃反應30min。試劑盒純化酶切產物。質粒酶切：pET-28a 5μL(1.5μg)，H2O 45μL，10×Cut Smart Buffer 6μL，BamH I和Xho I各3μL，37℃，酶切2h。膠回收酶切質粒。將酶切的pET-28a 4μL、PCR產物1μL與Solution I 5μL混勻，16℃連接過夜。熱激法將連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，含100μg/mL卡那霉素(Kana)的LB平板篩選抗性菌落。

1.4 鑒定重組質粒

挑抗性菌落1個，接種于5mL含100μg/mL Kana的LB中，37℃ 250r/min，培養(yǎng)12h，提取質粒(記為pS1)，酶切鑒定。酶切體系：重組質粒pS1 10μL(1μg)，H2O 15μL，10×Cut Smart Buffer 3μL，BamH I和Xho I各1μL?；靹颍?7℃酶切30min，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段。重組質粒送華大基因公司測序。

1.5 IPTG誘導rSAA表達

將質粒pET-28a、pS1適當稀釋,取5μL(10ng)，熱激法轉化BL21(DE3)。挑含pET-28a或pS1的單菌落，分別記為BL-28a、BL-pS1，接種于5mL含100μg/mL Kana的LB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)過夜，作種子液。按文獻[3]擴大培養(yǎng)BL-28a和BL-pS1，IPTG誘導rSAA表達。

1.6 rSAA活性測定

按文獻[4]用pH6.8的磷酸緩沖液配制1%淀粉溶液(簡稱淀粉液)。取兩只EP管，分別標記為C、T，按表1加入試劑，混勻，1 000r/min室溫離心1min，37℃水浴反應10min，每管加入50μL碘液，混勻，觀察顏色。

表1 rSAA活性鑒定

2 結 果

2.1 SAA的PCR擴增及重組質粒的鑒定

PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1A(封三)，可知，擴增產物分子量與SAA cDNA分子量(1 736bp)相符(圖1箭頭示)。

重組子質粒pS1經BamH I+Xho I雙酶切產生的小片段與SAA cDNA分子量相符(圖1B箭頭示)，提示PCR產物成功插入pET-28a載體中。測序測定結果表明插入至pET-28a中的PCR產物與Genebank中SAA cDNA(編號：BC144452.1)完全一致，讀碼框正確。

2.2 rSAA的表達及活性鑒定

rSAA分子量約55kDa，BL-28a經1mmol/L IPTG誘導和BL-pS1不經IPTG誘導表達后的上清均無55kDa的蛋白條帶出現(xiàn)(圖2A 1、2泳道，封三)；BL-pS1經1mmol/L IPTG誘導表達后的上清有約55kDa的蛋白條帶出現(xiàn)(圖2A 3泳道，箭頭示)，與rSAA分子量相符。

淀粉被淀粉酶水解依次生成的紫色糊精、紅色糊精、無色糊精和麥芽糖，與碘反應的顏色依次為紫色、紅色、無色、無色。BL-pS1未經IPTG誘導的上清與淀粉液反應產物與碘液反應顯示藍色(圖2B-C)，提示淀粉未被水解，表明上清液中無唾液淀粉酶。BL-pS1經1mM IPTG誘導表達后的上清與淀粉液反應產物遇碘液顯示無色(圖2B-T)，提示淀粉被完全水解，表明裂解液上清中存在有活性的唾液淀粉酶。

3 討 論

基因工程菌BL-pS1經IPTG誘導，表達了可溶性rSAA，rSAA無需純化即能高效催化淀粉水解。本文實驗條件下，200mL的發(fā)酵液可獲得30mL裂解液上清。按表1中rSAA用量，30 mL裂解液上清可以進行約300次酶促反應，發(fā)酵表達的rSAA即能為影響酶促反應因素的實驗教學提供大量的酶?；蚬こ叹鶥L-pS1可用甘油溶液低溫保存數(shù)年，即用即取。rSAA的裂解液上清可以利用蛋白質保存液長期保存于-80℃，不會失活，極大方便了實驗教學。rSAA溶于pH6.8(SAA的最適pH)磷酸緩沖液中，與淀粉溶液的pH一致，加入反應體系后，不改變體系的pH,確保SAA活性最高。溶于磷酸緩沖液中的rSAA分散性好，不粘稠，易于吸取和精確控制用量。鑒于rSAA的上述優(yōu)點，筆者擬在后續(xù)的實驗教學中用其取代從唾液中SAA進行實驗。