劉林紅，張 華，張 穎，胡美玲，張 斌※

（1.重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶 400011；2.山東省濟南市天橋區(qū)疾病預防控制中心，山東 濟南 250031）

皮膚鱗狀細胞癌簡稱皮膚鱗癌，是最常見的皮膚惡性腫瘤，來源于皮膚表皮細胞或者皮膚附屬器，易在皮膚表面形成潰瘍，損毀患者容貌，嚴重影響患者生存質量、威脅患者健康[1]。鱗癌的確切發(fā)病機制目前仍不十分清楚[2]。研究發(fā)現(xiàn)，核激素受體家族成員在調節(jié)皮膚發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，具有調節(jié)細胞代謝、增殖、分化、凋亡等作用并參與了炎癥反應，而其參與調節(jié)細胞過程的能力，也讓其成為調節(jié)人類皮膚疾病的有力的作用靶點[3-5]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，皮膚角質形成細胞中存在大量核激素受體家族成員的表達，提示表皮是核激素受體的主要靶器官[6]。作為表皮來源的惡性腫瘤，在皮膚鱗狀細胞癌中，核激素受體的表達水平如何？與正常細胞相比，兩者之間受體的表達是否存在差別？這種表達差異的了解無論對于了解鱗癌的發(fā)病機制或對腫瘤治療都具有重要意義。因此，本研究采用正常角質形成細胞作為對照，觀察皮膚鱗癌A431細胞中核激素受體的表達情況，探索核激素受體在正常細胞與腫瘤細胞表達的差異，旨在加深對皮膚腫瘤發(fā)生的機制了解，以選擇性地采用更有效的靶向藥物，改善臨床治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人皮膚正常角質形成細胞和人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431細胞購自美國組織培養(yǎng)庫（American Tissue Culture Collection）。DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司）、角質形成細胞培養(yǎng)基（ATCC）、青霉素-鏈霉素溶液（美國Cellgro公司）、RNeasy Mini試劑盒、RT2 First Strand試劑盒、RT2 SYBR Green qPCR Mastermix和RT2 Profiler PCR Array Plate（美國Qiagen公司）。

1.2 實驗方法 ① 細胞培養(yǎng)：在37℃、含5%CO2及飽和濕度的孵箱中，用細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，每2天更換培養(yǎng)液1次，當單層培養(yǎng)的細胞達到大于90%融合時，按細胞培養(yǎng)常規(guī)用0.25%胰蛋白酶液+0.02%乙二胺四乙酸消化細胞，用于傳代，鏡下觀察，及時用胰蛋白酶終止液終止消化。② 細胞RNA的提取、逆轉錄、Real-time PCR：以每孔2×105細胞濃度將角質形成細胞和皮膚鱗狀細胞癌A431細胞接種于6孔板，待細胞接近90%融合時，裂解細胞后提取RNA。使用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計（美國Thermo公司）分別測定波長為260nm與280nm（A260和A280）條件下RNA樣本的吸光度值，系統(tǒng)自動計算RNA濃度（待測樣本A260/A280比值在1.8～2.0范圍內，提示RNA純度較高）。提取的RNA參照RT試劑盒（RT2 First Strand Kit）說明進行逆轉錄（reverse transcription,RT）反應。按照RT2 Profiler PCR Array Plate試劑盒的操作說明配置反應體系，使用LightCycler 480II實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行Real-time PCR擴增。

1.3 數據分析 采用2-△△CT法對基因表達變化進行相對比較分析。從PCR系統(tǒng)中獲取原始CT值后，帶入EXCEL中計算各自基因的相對表達量?！鰿T=CT靶基因-CT內參照基因，2-△CT所得數值即為各自基因的相對表達水平[7]?！鳌鰿T=△CTA431—△CTKC，2-△△CT所得數值即為皮膚鱗癌A431細胞中與正常角質形成細胞相比，各對應核激素受體基因mRNA表達水平的倍數變化。

2 結果

2.1 正常人皮膚角質形成細胞和皮膚鱗狀細胞癌細胞中核激素受體家族成員的表達 正常人皮膚角質形成細胞和皮膚鱗狀細胞癌細胞中均有核激素受體家族成員的表達，按照基因表達值的高低，可見正常角質形成細胞不同強度表達的基因在A431細胞中有不同的變化趨勢（見表1、圖1）。A431細胞中表達量較高的受體中以RXR二聚體家族成員為主，如VDR、RXR、RAR、PPAR以及LXR等，還包括數個孤兒受體，如NR2F2、NR2C1、NR2C2、NR1D2等（見圖2）。

圖1 角質形成細胞和皮膚鱗狀細胞癌細胞中核激素受體mRNA相對表達量（2-△CT）

圖2 皮膚鱗狀細胞癌細胞中核激素受體mRNA相對表達量（2-△CT）

表1 角質形成細胞和皮膚鱗狀細胞癌細胞中核激素受體的相對表達量（±s）

表1 角質形成細胞和皮膚鱗狀細胞癌細胞中核激素受體的相對表達量（±s）

角質形成細胞 皮膚鱗狀細胞癌細胞A431 NR2F2 0.954 0±0.031 2.994 0±0.252 2 VDR 0.946 5±0.063 7 0.894 3±0.078 6 RXRα 0.847 7±0.001 4 3.899 9±0.506 4 NR3C1(GRα) 0.625 1±0.100 8 0.625 7±0.041 PPARδ 0.571 1±0.116 8 0.746 9±0.061 2 RXRβ 0.546 6±0.016 6 0.639 5±0.018 3 NR1H2(LXRβ) 0.286 1±0.014 5 0.443 5±0.042 5 RARγ 0.184 1±0.021 1 0.840 8±0.021 9 NR2C1 0.178 4±0.026 3 0.296 2±0.015 5 NR2C2 0.176 5±0.000 3 0.191 1±0.013 7 NR1D2 0.171 6±0.008 2 0.969 9±0.097 7 AHR 0.167 9±0.011 7 0.406 6±0.011 9 NR2F6 0.156 1±0.007 5 0.259 6±0.040 6 PPARα 0.085 1±0.025 5 0.216 0±0.012 9 RARα 0.044 7±0.003 5 0.132 6±0.015 5 THRA 0.036 2±0.000 1 0.131 2±0.003 9 RORα 0.026 3±0.001 8 0.000 2±0.000 6 THRβ 0.019 3±0.000 7 0.080 1±0.011 6

2.2 皮膚鱗狀細胞癌細胞中核激素受體mRNA的相對表達變化 A431細胞中多數RXR二聚體家族成員表達水平較正常角質形成細胞明顯升高，其中以PPARγ、RXRs、RARs變化水平最為顯著。此外，大量孤兒受體在鱗癌A431細胞中的表達也顯著升高，包括NR4A1、NR2F1、NR2F2、NR1D2、NR1D1等（見表2）。

表2 A431 中表達增高的核激素受體基因及其表達倍數（與KC相比）

3 討論

核激素受體超家族是目前真核生物體內含量最豐富的轉錄因子超家族成員的一員，與一系列有效轉錄所必需的輔活因子或輔遏阻子發(fā)生相互作用，并與基礎轉錄機制一起，調節(jié)不同靶基因的啟動子、配體或細胞類型特異性的表達。核激素受體家族成員參與胚胎發(fā)育、細胞分化和細胞內環(huán)境穩(wěn)定等多種生理過程，并在相關靶基因的正性及負性調控中發(fā)揮著重要的作用。其中糖皮質激素、雄激素以及雌激素受體對皮膚的作用最早研究[8-9]，其配體已被大量應用于臨床治療。同源序列比對發(fā)現(xiàn)了相關受體的全部超家族成員，很多成員在維持皮膚平衡方面發(fā)揮了重要作用。其中一組與RXR形成異源二聚體的核激素受體亞群成員，在皮膚生理功能中發(fā)揮尤其關鍵的作用，其中包括RARs、VDR、LXRs和PPARs等[10-12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚主要構成細胞中存在大量核激素受體成員的表達，提示該家族成員在皮膚發(fā)育中發(fā)揮重要作用[6]。

有關核激素受體研究的積累已逐漸讓人們認識到，核受體及其調控的代謝通路的紊亂也可導致糖尿病，腫瘤等許多病理過程。繼Q蛋白耦聯(lián)受體和離子通道之后，核受體已成為第三大類非酶性治療靶點；而基于核激素受體成員與腫瘤發(fā)生關系的不同認識，腫瘤防治研究工作也逐漸將核受體這一作用靶點重視起來。比如，由雌激素受體α介導的反應被證實是乳腺癌發(fā)病的重要病因。臨床乳腺癌患者中，75%以上腫瘤組織有ERα表達，這部分腫瘤對抗激素治療敏感，預后也較好，反之，ERα表達陰性的乳腺癌患者預后較差[13]，因此ERα已成為作為臨床區(qū)分病人并采取不同治療措施的重要參考指標之一。此外，在上皮細胞來源的前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，AR在其中起到關鍵作用，原發(fā)前列腺癌細胞的增殖需要雄激素的刺激完成，雄激素耗竭療法也因而成為臨床上抑制前列腺癌發(fā)展的標準方案[14]。大量研究表明，多種腫瘤組織或相應細胞中存在著RARs以及RXRs的表達異常[15-16]。而作為目前已經有確定配體的核激素受體家族成員，其配體已被廣泛用于對治療頭頸部、肺等部位癌前病變及降低繼發(fā)性癌的發(fā)生率有很好療效，在皮膚癌、乳腺癌以及宮頸癌等多種惡性腫瘤治療中已進入臨床研究階段，我們的研究也發(fā)現(xiàn)在皮膚鱗狀細胞癌細胞中，RXR和RAR的表達水平均較正常細胞升高，根據核激素受體的特性，這也能解釋臨床上廣泛使用的維甲酸藥物治療能明顯抑制腫瘤生長，降低腫瘤的發(fā)病率。但同前所述，維甲酸的副作用在很大程度上限制了其在臨床的廣泛使用，為了研制出更加有效的維甲酸受體藥物，從而得以進行更加有效的治療，尤其需要針對與腫瘤相關的維甲酸受體的轉錄、翻譯和磷酸化調節(jié)的分子機制開展深入的病理、生理學研究。隨著對維甲酸作用機理認識的深入，尋找選擇性更強，毒副作用更小的新型維甲酸配體用于靶向治療，必將在未來的腫瘤治療中發(fā)揮更大的作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚鱗狀細胞癌細胞中也存在大量核激素受體成員，尤其是RXR異構二聚體家族成員的表達，與正常角質形成細胞相比，多數RXR異構二聚體受體家族成員的mRNA表達水平升高，其中PPARγ在正常角質形成細胞中表達水平很低，但在皮膚鱗狀細胞癌中表達明顯升高，這種表達異常的升高是腫瘤發(fā)生的始動環(huán)節(jié)抑或為腫瘤治療提供了特異性靶點，尚有待進一步研究證實。

除上述核激素受體外，皮膚鱗癌A431細胞中也存在大量孤兒受體的表達，且部分孤兒受體在A431細胞中的表達較正常細胞明顯升高，比如NR2F2、NR2F1、NR2D2等成員，但由于目前針對這些受體的研究較少，尚不能確定這些受體在皮膚鱗癌發(fā)生及治療中的可能作用。隨著對孤兒受體結構和功能的確定，應用高通量篩選和虛擬高通量現(xiàn)代科技手段，以核受體為靶標的藥物研究將成為現(xiàn)代藥物研究的一大熱點。