李陽(yáng)芳，胡慧敏*

(1.北京市神經(jīng)外科研究所，北京 100070； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 神經(jīng)外科，北京 100070)

垂體瘤(putuitary tumor)起源于顱內(nèi)腺垂體，是神經(jīng)外科常見(jiàn)的腫瘤之一，傳統(tǒng)流行病學(xué)資料中垂體瘤約占顱內(nèi)腫瘤的10%～12%，年發(fā)病率約為(0.8～1)/10萬(wàn)，但有報(bào)道稱垂體瘤尸檢發(fā)現(xiàn)率高達(dá)14.4%，隨機(jī)人群磁共振影像(magnetic resonance imaging MRI)檢出率為22.5%[1]。 垂體瘤好發(fā)于青壯年，較其他顱內(nèi)腫瘤對(duì)人的身心健康更具危害性，對(duì)患者的生長(zhǎng)、發(fā)育、勞動(dòng)能力、生育功能等都有嚴(yán)重影響。無(wú)功能垂體腺瘤(non-functional pituitary adenomas,NFPAs)是垂體瘤中的一種，約占垂體瘤的25%，由于NFPAs在發(fā)展初期缺乏臨床癥狀，直至生長(zhǎng)為大腺瘤才被發(fā)現(xiàn)，這時(shí)NFPAs多數(shù)已侵犯周?chē)M織呈侵襲性生長(zhǎng)，手術(shù)難以完全切除并且極易復(fù)發(fā)[2]，所以結(jié)合放射治療(簡(jiǎn)稱放療)起到重要的補(bǔ)充作用，但并不是所有的患者都適合放療，非必要的放療易引起患者的垂體功能低下和視神經(jīng)損傷等，造成二次損傷[3]，所以需要篩選關(guān)鍵基因作為分子標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)垂體瘤對(duì)放射線的抵抗及敏感。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子是DNA損傷修復(fù)通路的重要組成部分，正常生理?xiàng)l件下，其能夠調(diào)控細(xì)胞增殖進(jìn)程，作用于細(xì)胞分裂保持細(xì)胞增殖；而放療情況下，由于DNA損傷應(yīng)答機(jī)制的啟動(dòng)，細(xì)胞周期通路開(kāi)始響應(yīng)并啟動(dòng)細(xì)胞周期捕獲，參與DNA損傷修復(fù)過(guò)程，引發(fā)放療抵抗[4-5]。本課題利用NFPAs組織芯片對(duì)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑1A(cycle-dependent kinase inhibitor 1A,p21)等與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合臨床信息分析影響放療敏感的分子標(biāo)志物，篩選到垂體瘤轉(zhuǎn)化基因(pituitary tumor transforming gene,PTTG)和p21 兩個(gè)能夠指示垂體瘤對(duì)放射線敏感程度的蛋白，作為放療預(yù)后的預(yù)測(cè)分子，并初步評(píng)估其在預(yù)測(cè)NFPAs放療耐受中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

89例無(wú)功能垂體瘤樣本取自垂體瘤切除術(shù)后的組織標(biāo)本，來(lái)源于北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科研究所垂體瘤樣本庫(kù)，所有樣本來(lái)源患者均已簽署了知情同意書(shū)；本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY2019-144-01)。

抗Ki67兔多克隆抗體、 抗PTTG小鼠單克隆抗體、 抗p53 小鼠單克隆抗體、抗p21小鼠單克隆抗體、抗p15兔多克隆抗體、抗p16小鼠單克隆抗體、抗MDM2小鼠單克隆抗體、抗CDK2小鼠單克隆抗體、抗CDK4兔單克隆抗體、抗CCND1兔單克隆抗體、抗CCND3小鼠單克隆抗體、 抗CCNE1小鼠單克隆抗體、抗RB兔單克隆抗體、抗c-Myc小鼠單克隆抗體、抗E2F1兔多克隆抗體和抗E2F4兔單克隆抗體(均英國(guó)Abcam 公司)；徠卡免疫組化試劑盒(徠卡生物系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 整理患者臨床信息及隨訪資料：包括患者年齡、性別、腫瘤體積、侵襲情況、伽馬刀參數(shù)(中心劑量、邊緣劑量和等劑量線)、頭痛、視神經(jīng)受損及放療引起的激素缺乏癥。患者伽馬刀放射外科治療(gamma knife radiosurgery,GKRS)(簡(jiǎn)稱伽馬刀治療)后的1～10年期間進(jìn)行隨訪，并將磁共振影像作為分組依據(jù)，與伽馬刀治療前相比，垂體瘤體積縮小≥20%為放療敏感組，其余為放療耐受組。

1.2.2 組織芯片的制備：根據(jù)伽馬刀治療時(shí)間2003—2009年的患者樣本為研究組(tissue microarray,TMA-1)；2010—2013年的為驗(yàn)證組(TMA-2)，所有患者均按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行伽馬刀治療。所有樣本用甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋；在光學(xué)顯微鏡下，利用蘇木精和伊紅染色的載玻片選取了每個(gè)腫瘤的3個(gè)不同區(qū)域，然后使用組織芯片儀從石蠟包埋的組織塊中取出3個(gè)1.0 mm的蠟芯，并在組織微陣列中隨機(jī)排列，確保每個(gè)樣本3復(fù)孔。使用連續(xù)切片機(jī)將組織微陣列塊切成4微米的切片，即組織芯片，在-20℃保存至使用。

1.2.3 組織芯片的免疫組化染色：組織芯片均使用徠卡免疫組化自動(dòng)儀進(jìn)行組織染色，按照徠卡免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；使用一抗的稀釋比為: 抗Ki67兔多克隆抗體(1∶500)、 抗PTTG小鼠單克隆抗體(1∶500)、 抗p53 小鼠單克隆抗體(1∶800)、 抗p21小鼠單克隆抗體(1∶400)、 抗p15兔多克隆抗體(1∶500)、 抗p16小鼠單克隆抗體(1∶600)、 抗MDM2小鼠單克隆抗體(1∶200)、 抗CDK2小鼠單克隆抗體(1∶50)、抗CDK4兔單克隆抗體(1∶50)、 抗CCND1兔單克隆抗體(1∶6)、 抗CCND3小鼠單克隆抗體(1∶200)、 抗CCNE1小鼠單克隆抗體(1∶100)、 抗RB兔單克隆抗體(1∶600)、 抗c-Myc小鼠單克隆抗體(1∶200)、 抗E2F1兔多克隆抗體(1∶500)、抗E2F4兔單克隆抗體(1∶500)；抗體染色后，所有組織芯片用樹(shù)脂黏合劑固定。

1.2.4 組織芯片的判讀：利用徠卡Aeprio AT2掃描系統(tǒng)，掃描組織芯片，核查確定腫瘤區(qū)域后，去除雜質(zhì)及非特異染色區(qū)，對(duì)組織芯片進(jìn)行判讀，同時(shí)設(shè)定核陽(yáng)性、漿陽(yáng)性和膜陽(yáng)性，并對(duì)染色深淺進(jìn)行打分，總分=1×(1分%)+2×(2分%)+3×(3分%)，總分?jǐn)?shù)為0-300區(qū)間。CDK4、PTTG和p21在細(xì)胞核和胞質(zhì)中都有表達(dá)，所以分別打分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

研究組的樣本共61例，包含27例敏感，34例抵抗；而驗(yàn)證組為28例，包含12例敏感，16例抵抗。收集病人基本資料及臨床信息列于表1，結(jié)果顯示本樣本集群的臨床數(shù)據(jù)與放療抵抗無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。

表1 患者臨床信息與放療抵抗之間的單因素分析

研究組(TMA-1)的 PTTG細(xì)胞核和p21細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)與腫瘤的放療耐受顯著相關(guān)(P<0.05和P<0.01)；在驗(yàn)證組(TMA-2)中，再次印證PTTG細(xì)胞核和p21細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)與腫瘤放療耐受之間的關(guān)系(P<0.01)(表2)。

表2 蛋白分子標(biāo)志物與TMA1和TMA組放療抵抗之間關(guān)系的單因素分析

根據(jù)組織芯片PTTG細(xì)胞核染色評(píng)分(0～150)，將PTTG表達(dá)情況分為PTTG核陰性(PTTG-nu-)，即無(wú)表達(dá)；PTTG核陽(yáng)性(PTTG-nu+)，包括低表達(dá)和高表達(dá)。同樣，根據(jù)p21細(xì)胞質(zhì)染色評(píng)分(0～300)，分?jǐn)?shù)為0～149的為p21無(wú)表達(dá)和低表達(dá)(p21-cyL/-)；分?jǐn)?shù)為150～300的為p21高表達(dá)(p21-cyH)。PTTG和p21在無(wú)功能垂體瘤組織芯片中的蛋白表達(dá)情況(圖1)。

在研究組中，PTTG細(xì)胞核陰性、p21細(xì)胞質(zhì)無(wú)/低表達(dá)與腫瘤的放療敏感性高度相關(guān)(P<0.01)。驗(yàn)證組再次證明了上述結(jié)果(P<0.05)(圖2)。

3 討論

既往研究主要集中于臨床信息與垂體瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系，對(duì)于預(yù)測(cè)垂體瘤放療預(yù)后的分子標(biāo)志物的研究鮮有報(bào)道。本研究嘗試?yán)媚[瘤放療后體積的變化來(lái)反映垂體瘤對(duì)射線的敏感程度，并結(jié)合臨床信息和蛋白表達(dá)情況，篩選到PTTG和p21兩個(gè)能夠預(yù)測(cè)無(wú)功能垂體瘤放療耐受的分子標(biāo)志物，即細(xì)胞核PTTG和細(xì)胞質(zhì)p21表達(dá)的升高很可能預(yù)示無(wú)功能垂體瘤放療耐受。

PTTG是在垂體瘤中發(fā)現(xiàn)的原癌基因，同時(shí)也是細(xì)胞分裂中重要調(diào)節(jié)蛋白[6]，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)。在直腸癌的研究中，PTTG就是放射耐受的分子標(biāo)志物，高表達(dá)PTTG的直腸癌表現(xiàn)出放療抵抗[7]。體外實(shí)驗(yàn)也證明PTTG的過(guò)表達(dá)抑制了癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)了對(duì)射線的抵抗力[8]。這點(diǎn)與本研究的結(jié)果相一致。PTTG的機(jī)制研究顯示，其能夠下調(diào)了DNA損傷反應(yīng)基因，包括p53靶基因BRCA1[9]，甚至與p53相互作用抑制p53活性，與ku70相互作用抑制DNA損傷反應(yīng)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞凋亡[10]。這從機(jī)制上解釋了：PTTG的表達(dá)可能阻止了由射線引起的垂體瘤細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞衰老是輻射后細(xì)胞死亡的重要途徑之一。經(jīng)典的p53/p21信號(hào)通路在細(xì)胞衰老中起關(guān)鍵作用，有報(bào)道稱PTTG與p53/p21通路相互作用調(diào)節(jié)垂體瘤細(xì)胞衰老[11]。p21是細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑， 其在亞細(xì)胞的定位代表了不同的生物學(xué)功能，如核定位顯示增殖抑制和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)誘導(dǎo)活性，而細(xì)胞質(zhì)定位則顯示抗凋亡和促癌活性[12]。細(xì)胞質(zhì)中的p21能與半胱天冬酶-3酶原(pro-caspase-3)或凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulatting kinase 1,ASK1)聯(lián)合作用以阻止細(xì)胞凋亡，pro-caspase-3是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要基因，而ASK1則激活MAPK通路對(duì)細(xì)胞凋亡做出反應(yīng)[13-14]。這從理論上印證了本研究的結(jié)果，那就是細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)p21的NFPAs更能抵御放療引起的細(xì)胞凋亡。

Negative, low and high expression of PTTG and p21 in either nuclear or cytoplasm of NFPAs; scale bar=50 μm圖1 PTTG和p21在NFPAs組織芯片(TAM)中表達(dá)情況Fig 1 Expression of PTTG and p21 in NFPAs tissue microarray(TAM)

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NFPAs細(xì)胞核PTTG或細(xì)胞質(zhì)p21表達(dá)升高的病人更易于引發(fā)放療耐受，PTTG和p21可能作為NFPAs預(yù)后的預(yù)測(cè)分子，指導(dǎo)垂體瘤臨床診治；預(yù)測(cè)分子的發(fā)現(xiàn)將進(jìn)一步闡釋NFPAs放療抵抗的機(jī)制，開(kāi)發(fā)針對(duì)關(guān)鍵基因的藥物對(duì)放療耐受進(jìn)行緩解，增加放射治療敏感度。

A,B.negative nuclear PTTG and low cytoplasmic p21 were significantly related to radiosensitive (P=0.007 6 and 0.003 4, respectively) in the study set; C, D.nuclear PTTG and cytoplasmic p21 level were significantly related to radiosensitive rate (P=0.042 8 and 0.003 5, respectively) in the validation set