朱澤健，張超，曾潔，張傳寶

技術(shù)與方法·

一種高效制備α-L-巖藻糖苷酶的方法和應(yīng)用

朱澤健，張超，曾潔，張傳寶

100730 北京，北京醫(yī)院/國家老年醫(yī)學(xué)中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院/國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心/北京市臨床檢驗工程技術(shù)研究中心/（朱澤健、張超、曾潔、張傳寶）；100730 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院（朱澤健、張傳寶）

α-L-巖藻糖苷酶（α-L-fucosidase，AFU）[EC 3.2.1.51]是一種外切糖苷酶，從細(xì)菌到哺乳動物體內(nèi)都廣泛存在[1]，參與多種基礎(chǔ)生化反應(yīng)。免疫化學(xué)交叉反應(yīng)和純系化研究顯示，不同物種間 AFU 的氨基酸序列與結(jié)構(gòu)十分相似，具有較高的保守性[2]。人體中存在高分子量（約 100 kD）和低分子量（約50 kD）兩種形態(tài)的 AFU，高分子量的 AFU 是唾液酸糖蛋白，由兩個低分子量的單體組成，而低分子量形式是中性的富含甘露糖的糖蛋白，兩種形式都可以聚集為四聚體或六聚體形式[3]。人體內(nèi)的 AFU 廣泛分布于各種組織及體液中，如胎盤、胎兒組織、腦、肺、肝、胰、腎，以及血清、尿液、唾液、淚液等。從人脾臟、肝、腦和腎臟中純化得到的 AFU 具有明顯同質(zhì)性，其中以肝、腎等組織活性較高，細(xì)胞內(nèi)的 AFU 則主要位于溶酶體內(nèi)[4]。

AFU 在臨床的應(yīng)用最早開始于對因先天缺乏 AFU 引起的巖藻糖苷貯積病的輔助診斷[5]。自 1984 年 Deugnier 等[6]首次報道肝細(xì)胞癌患者血清中 AFU 升高后，關(guān)于 AFU 在血清或組織中的活性改變與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性研究也越來越多。檢測血清 AFU 聯(lián)合其他常規(guī)檢驗項目對肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌等肝臟疾病及其他惡性腫瘤[7-9]的預(yù)后以及提高診斷靈敏度、特異度等具有積極意義。

目前臨床上測定 AFU 的方法主要為 2-氯-4-硝基苯- α-L-巖藻糖苷（CNPF）速率法[10]。臨床實驗室使用的AFU 質(zhì)控品和參考物質(zhì)通常從人血清中獲得，成本高，產(chǎn)率低。此外，大多數(shù)高值 AFU 樣本來自惡性腫瘤患者，大大減少了生產(chǎn)來源。因此，從大腸桿菌中表達和純化更高濃度的 AFU 可為臨床實驗室提供更優(yōu)質(zhì)、更廉價的質(zhì)控品和候選參考物質(zhì)。

本研究構(gòu)建原核表達質(zhì)粒 6His-AFU-pRSFDuet，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達并純化。大腸桿菌是一種應(yīng)用廣泛的表達宿主，它以簡單、快速和經(jīng)濟的方式生長，可高效、快速地獲取高純度 AFU。同時，6His 標(biāo)簽?zāi)苡行У胤蛛x目的蛋白質(zhì)，最終獲得完整且具有生物活性的AFU。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料DH5α 菌株及BL21 Codon Plus 購買自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；質(zhì)粒 pRSFDuet 由北京醫(yī)院國家老年醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點實驗室細(xì)胞室惠贈。

1.1.2 試劑 限制性核酸內(nèi)切酶R I、H I 以及 T4 DNA 連接酶購自 Thermo Fisher 公司；質(zhì)粒提取試劑盒及 DNA 凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；LB 培養(yǎng)基預(yù)混合粉末、卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、聚丙烯酰胺、Tris 堿、NaCl、咪唑均購自上海生工生物股份有限公司；BCA 蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AFU 雙試劑檢測試劑盒購自北京九強生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 37 ℃恒溫?fù)u床購自蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司；DNA 電泳儀和蛋白電泳儀購自北京市六一儀器廠；PCR 儀購自杭州博日科技有限公司；Ni-NTA 鎳離子親和樹脂及鎳離子親和層析柱購自上海生工生物工程股份有限公司；超聲細(xì)胞粉碎儀購自上海力辰邦西儀器科技有限公司；7180 全自動生化分析儀購自日本日立有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基預(yù)混合粉末按照 25 g/L 溶解至超純水中，121 ℃高壓滅菌 15 min；固體 LB 培養(yǎng)基加入 15 g/L 瓊脂。以上培養(yǎng)基均加入終濃度 50 μg/ml 卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 人組織 AFU 基因合成 從 NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索獲得人組織 AFU 編碼序列，委托華大基因合成。

1.2.2 表達載體構(gòu)建 設(shè)計引物通過 PCR 為人組織 AFU 基因 N 端增加H I 酶切位點，C 端增加R I 酶切位點。將雙酶切片段插入到 pRSFDuet 載體，利用 T4 DNA 連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 菌株，利用 Kan+抗性篩選，通過菌落 PCR 對陽性克隆進行鑒定，提取得到 6His-AFU-pRSFDuet 質(zhì)粒，測序鑒定序列。

1.2.3 重組 AFU 的表達 將構(gòu)建好的 6His-AFU-pRSFDuet 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Codon Plus，挑取單菌落接種至 5 ml LB 培養(yǎng)基 37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。以 1:250 體積比將菌液接種至 250 ml LB 培養(yǎng)基，在 37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至600= 0.6 ～ 0.8，向培養(yǎng)基中加入終濃度為 0.5 mmol/L的 IPTG，25 ℃、160 r/min 誘導(dǎo) 20 h。所有誘導(dǎo)后的菌液3500 r/min 離心 20 min 收集菌體，菌體重懸于 20 ml 蛋白提取緩沖液（50 mmol/L Na3PO4，pH 8.0，150 mmol/L NaCl）中，冰浴條件下使用超聲細(xì)胞粉碎儀超聲 6 min（超聲 1 s，間隔 2 s）破碎裂解菌體，裂解產(chǎn)物 9500 r/min、4 ℃離心 15 min，分離上清液與沉淀。

1、2：兩個單菌落的 PCR 產(chǎn)物；M：DNA marker

1.2.4 重組 AFU 表達條件優(yōu)化 在 0.5 mmol/L IPTG，25 ℃、160 r/min 的條件下誘導(dǎo) 5、10、15、20、25 h；確定最佳誘導(dǎo)時間后，在 0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L 的 IPTG，25 ℃、160 r/min 的條件下誘導(dǎo) 20 h，以獲得重組 AFU 誘導(dǎo)表達最優(yōu)的時間與 IPTG 濃度。

1.2.5 重組 AFU 的純化 將裂解上清液與 500 μl Ni-NTA 親和樹脂在 4 ℃充分混勻 1 h，用 10 mmol/L 咪唑清洗非特異性結(jié)合，最后用 250 mmol/L 咪唑洗脫重組人 6His-AFU 蛋白。

1.2.6 重組 AFU 活性檢測 使用日立 7180 全自動生化分析儀搭配九強 AFU 雙試劑檢測試劑盒測定重組 AFU 活性。

2 結(jié)果

2.1 高效表達載體的獲得

圖 1A 為所用 6His-AFU-pRSFDuet 載體結(jié)構(gòu)圖。AFU 基因由 T7 啟動子控制，在 N端融合了 6His 標(biāo)記用于靶蛋白的純化。經(jīng)抗生素篩選的單菌落經(jīng)菌落 PCR 擴增出約 1600 bp 的片段，與預(yù)期片段大小一致（圖 1B），提取質(zhì)粒送測序，經(jīng)過 SnapGene 軟件對比，質(zhì)粒測序結(jié)果與預(yù)期的質(zhì)粒圖譜完全一致，表明 6His-AFU-pRSFDuet 質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 6His-AFU-pRSFDuet 的表達分析

將所構(gòu)建的表達載體 6His-AFU-pRSFDuet 轉(zhuǎn)化BL21 Codon Plus。經(jīng) LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)及 IPTG 誘導(dǎo)表達后，將菌體離心、破碎，上清與鎳柱親和層析，咪唑洗脫的蛋白液經(jīng) SDS-PAGE 電泳。如圖 2 所示，在親和純化產(chǎn)物中可見約 52 kD 電泳條帶，大小與預(yù)期的 6His-AFU 相符，表明重組 AFU 蛋白成功表達。

1、2：超聲裂解產(chǎn)物沉淀；3、4：超聲裂解產(chǎn)物上清；5、6：AFU 純化產(chǎn)物；M：蛋白 marker

2.3 重組AFU 表達條件優(yōu)化

為提高表達效率，增加產(chǎn)量，對 AFU 誘導(dǎo)表達條件進行優(yōu)化。最優(yōu)誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑IPTG 濃度結(jié)果如圖 3所示。從圖 3B 可以看出，AFU 活性在 20 h 之后便不再增加，基于成本考慮，最優(yōu)誘導(dǎo)時間取 20 h。從圖 3D可以看出，AFU 活性在 0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)時最高，隨 IPTG 濃度升高而降低，因此本實驗最優(yōu) IPTG 濃度為0.1 mmol/L。

2.4 重組AFU 活性測定

酶的活性與其蛋白質(zhì)濃度與比活密切相關(guān)。使用 BCA 蛋白檢測法測定純化后樣本蛋白濃度，為 1593 mg/L。使用日立 7180 全自動生化分析儀搭配九強 AFU 雙試劑檢測試劑盒測定純化后 AFU 濃度為 8820 U/L。通過計算，最終制得的重組 AFU 比活為 5.54 U/mg。

圖3 不同誘導(dǎo)條件裂解產(chǎn)物上清 SDS-PAGE 電泳及活性測定[A：不同誘導(dǎo)時間裂解產(chǎn)物上清 SDS-PAGE 電泳（1 ～ 5：誘導(dǎo)時間 5、10、15、20、25 h；M：蛋白 marker；6：AFU 純化產(chǎn)物；7：E. coli BL21 Codon Plus）；B：裂解上清液 AFU 活性隨誘導(dǎo)時間的變化趨勢；C：不同 IPTG 濃度裂解產(chǎn)物上清 SDS-PAGE 電泳（1：E. coli BL21 Codon Plus；2：AFU 純化產(chǎn)物；M：蛋白marker；3 ～ 6：IPTG 濃度 0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L）；D：裂解上清液 AFU 活性隨 IPTG 濃度的變化趨勢]

3 討論

盡管多項研究發(fā)現(xiàn)血清 AFU 水平的變化與多種疾病尤其是惡性腫瘤相關(guān)，但大部分疾病引起 AFU 水平變化的生理機制尚不明確。近年來有更多的研究將關(guān)注點轉(zhuǎn)移到AFU 在惡性腫瘤組織中的定位與轉(zhuǎn)錄水平，這對 AFU 檢測的臨床意義和惡性腫瘤的診斷、治療和預(yù)后都將產(chǎn)生重要的影響。AFU 作為單獨檢測的診斷指標(biāo)時與多種疾病均有明顯相關(guān)，但特異性并不高，若聯(lián)合不同的指標(biāo)或同時檢測血清、尿液中的活性則可發(fā)揮比較好的指示作用。隨著 AFU 的臨床價值被逐漸揭示，AFU 檢測結(jié)果的一致化對于疾病準(zhǔn)確診斷具有重要意義。

目前尚無利用蛋白表達系統(tǒng)表達 AFU 重組蛋白的研究，獲取 AFU 純品不僅可以制備相關(guān)參考物質(zhì)，也為 AFU 的臨床和實驗室研究奠定基礎(chǔ)。原核表達系統(tǒng)作為目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白表達體系，優(yōu)點在于成本相對低廉，能夠在較短時間內(nèi)獲得大量目的蛋白。本研究采用原核表達系統(tǒng)表達重組 AFU，在 N 端添加了 6His 標(biāo)簽使目標(biāo)蛋白能夠進行親和純化。臨床 AFU 醫(yī)學(xué)決定水平為 40 U/L，目前市面上商品化的 AFU 質(zhì)控品活性大致分布在 10 ～ 40 U/L 區(qū)間。本研究最終制得的 AFU 純品活性高達 8820 U/L，滿足制備高水平AFU 參考物質(zhì)的濃度需求。

近年來，臨床實驗室用于質(zhì)量控制的參考物質(zhì)通常來源于人、牛或其他動物的血清樣品，成本高且制備過程復(fù)雜，并且人血清具有傳播傳染病的潛在風(fēng)險[11]。采用大腸桿菌這一簡單高效的表達系統(tǒng)，不僅能獲得大量具有生物活性的重組 AFU，而且能夠大大降低其在臨床生化實驗室中的應(yīng)用成本。目前 AFU 這一項目沒有國際公認(rèn)的參考測量程序及參考物質(zhì)，國內(nèi)也未開展過室間質(zhì)評計劃，一致化領(lǐng)域仍處于空白。該重組 AFU 的制備能夠為候選參考物質(zhì)工作提供純物質(zhì)原料，為后續(xù)的研究打下基礎(chǔ)，有潛力成為臨床實驗室常規(guī) AFU 質(zhì)控品及室間質(zhì)評計劃參考物質(zhì)。

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北京醫(yī)院“科技新星”項目（BJ-2020-087）

張傳寶，Email：cbzhang@nccl.org.cn

2021-01-29

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.014