孫靜靜，王格，趙巧輝，李桂林

·綜述·

哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO制備重組抗體關(guān)鍵技術(shù)研究進(jìn)展

孫靜靜，王格，趙巧輝，李桂林

450016 鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司

哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠提供復(fù)雜的翻譯后修飾，表達(dá)蛋白性質(zhì)與天然蛋白接近，使蛋白藥物更加穩(wěn)定有效。自 1987 年 FDA 批準(zhǔn)第一個(gè)中國(guó)新藥組織型纖溶酶原激活劑（TPA），哺乳動(dòng)物細(xì)胞廣泛應(yīng)用于重組蛋白的生產(chǎn)，開始了工業(yè)化生產(chǎn)之路。在生物制藥行業(yè)幾十年的快速發(fā)展中，哺乳動(dòng)物 CHO 細(xì)胞成功生產(chǎn)了眾多細(xì)胞因子、重組酶、重組抗體、重組融合蛋白等有價(jià)值的生物技術(shù)藥物，為市場(chǎng)需求作出重大貢獻(xiàn)，同時(shí)也奠定了它在生產(chǎn)細(xì)胞中的優(yōu)勢(shì)地位?？贵w藥物是現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的主力軍，占全球生物藥物市場(chǎng)的 50% 以上，是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)增長(zhǎng)最快的細(xì)分領(lǐng)域，抗體藥越來越多地應(yīng)用于幾乎所有的醫(yī)學(xué)分支，抗體療法的日益成功推動(dòng)了重組抗體技術(shù)和生產(chǎn)設(shè)施的設(shè)計(jì)和管理?？贵w藥物自身有著不容忽視的問題，如結(jié)構(gòu)復(fù)雜不穩(wěn)定、大規(guī)模生產(chǎn)復(fù)制困難、研發(fā)周期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、工藝復(fù)雜等[1]。隨著國(guó)內(nèi)抗體藥物的發(fā)展和應(yīng)用，降低成本成為企業(yè)的主要任務(wù)，提高蛋白表達(dá)量是降低成本的主要手段之一。提高外源蛋白表達(dá)水平的方法很多：包括目的基因序列優(yōu)化、分泌信號(hào)肽篩選、工藝流程相關(guān)參數(shù)優(yōu)化、培養(yǎng)基優(yōu)化及細(xì)胞株優(yōu)化等。本文重點(diǎn)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞 CHO 重組抗體制備上游關(guān)鍵技術(shù)因素包含宿主細(xì)胞、載體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備等進(jìn)行綜述，以期提供提升抗體表達(dá)量，降低成本的解決方案。

1 載體

CHO 細(xì)胞表達(dá)載體基本元件包括復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、poly A 加尾信號(hào)、篩選標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等。啟動(dòng)子一般較多采用 SV40 和 CMV 兩種，CMV 啟動(dòng)子通常位于目的基因之前，SV40 啟動(dòng)子位于篩選標(biāo)記之前。目的基因在 CHO 細(xì)胞中的表達(dá)受基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平及翻譯后修飾的效率、目的基因整合的染色體區(qū)域狀態(tài)和整合于宿主染色體的位置等諸多因素的影響，載體設(shè)計(jì)與優(yōu)化對(duì)于提高目的蛋白的表達(dá)量十分重要[2]。

1.1 常用載體

1.1.1 單順反子 早期進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)重組抗體構(gòu)建時(shí)，將抗體的重鏈序列（HC）和輕鏈序列（LC）分別構(gòu)建至兩個(gè)單順反子載體中，這種構(gòu)建方法缺點(diǎn)較多：①耗時(shí)且較難表達(dá)；②篩選穩(wěn)定株時(shí)需要 2 個(gè)不同的篩選標(biāo)記；③整合進(jìn)入宿主 DNA 的效率較低，影響表達(dá)。早期瞬時(shí)表達(dá)時(shí)常用單順反子構(gòu)建，便于快速表達(dá)，但表達(dá)量相對(duì)較低。由于輕鏈分子量較重鏈低，輕鏈表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，由于單順反子的劣勢(shì)較明顯，較少使用進(jìn)行大規(guī)模抗體的表達(dá)，需要進(jìn)行多順反子構(gòu)建[3]。

1.1.2 多啟動(dòng)子表達(dá)載體 多啟動(dòng)子表達(dá)載體包含不同的啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng) HC 和 LC 的轉(zhuǎn)錄和翻譯。Bayat 等[4]比較了單啟動(dòng)子、雙啟動(dòng)子和多啟動(dòng)子載體表達(dá)重組抗體，結(jié)果表明雙啟動(dòng)子載體表達(dá)最高，但由于每個(gè)基因受不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，會(huì)出現(xiàn) HC 和 LC 表達(dá)失衡的情況，導(dǎo)致兩個(gè)啟動(dòng)子相互干擾或抑制。在大部分情況，多啟動(dòng)子的容納能力是受限的，很難容納多于兩個(gè)啟動(dòng)單元，因此多啟動(dòng)子載體構(gòu)建應(yīng)用也受限。

1.1.3 三順反子載體 多順反子載體可在 1 條 mRNA 同時(shí)表達(dá) HC、LC 和篩選標(biāo)記，抗體的表達(dá)量高、集聚度低且糖基化均一。目前廣泛采用多順反子表達(dá)方案，常利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）或自剪切多肽 2A（self-cleaving 2A peptide，2A）等元件來連接多個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)在單個(gè)載體上表達(dá)多個(gè)多順反子的目的。Yeo 等[5]利用 IRES 構(gòu)建的三順反子（圖 1）在 CHO DG44 懸浮細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，利用兩個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）在一個(gè)轉(zhuǎn)錄本中表達(dá) LC、HC 和二氫葉酸還原酶（DHFR）選擇標(biāo)記基因。在此三順反子載體中，三個(gè)基因受一個(gè)含有核心 CpG 島元件（IE）的人巨細(xì)胞病毒（hCMV）啟動(dòng)子控制，可提高單抗的表達(dá)水平，減少聚集體產(chǎn)生。

圖1 IRES 介導(dǎo)的三順反子原理圖

1.2 定點(diǎn)整合

外源基因的轉(zhuǎn)錄水平在很大程度上受其整合于宿主染色體位點(diǎn)的影響，這種現(xiàn)象稱為位置效應(yīng)。工業(yè)界目前普遍采用了基于目的基因隨機(jī)整合構(gòu)建表達(dá)細(xì)胞株的方法。定點(diǎn)整合（site-specific integration，SSI）可將基因整合至染色體的特定穩(wěn)定熱點(diǎn)位置，實(shí)現(xiàn)外源基因高表達(dá)。特異性重組酶系統(tǒng)為基因定點(diǎn)整合提供了可能，已有很多關(guān)于 Cre/loxP、Flp/FRT、Bxb1 和 phiC31/R4 等重組酶成功應(yīng)用于外源基因定點(diǎn)整合的報(bào)道[6]。

2 CHO 細(xì)胞

2.1 宿主細(xì)胞種類

重組抗體/抗原表達(dá)最常用的宿主細(xì)胞有 CHO、NS0、Sp2/0、HEK293 和 PER.C6。其中 70% 工業(yè)化生產(chǎn)抗體藥物選擇 CHO 細(xì)胞進(jìn)行制備[7]。迄今已有 1360 種重組抗體/蛋白藥物選擇 CHO 細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，尤其是近10 年，有 467 種重組抗體/蛋白藥物選擇 CHO 細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。CHO細(xì)胞是生產(chǎn)蛋白類藥物的首選宿主細(xì)胞，因?yàn)榕c其他系統(tǒng)相比，CHO 細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：①對(duì)蛋白有準(zhǔn)確的加工、修飾功能，其表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白；②耐受剪切力和滲透壓的能力相對(duì)較強(qiáng)；③整合外源基因后的細(xì)胞穩(wěn)定，重組基因能高效擴(kuò)增和表達(dá)；④表達(dá)的目的蛋白可由細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，并且 CHO 細(xì)胞只表達(dá)少量的內(nèi)源蛋白，有利于目的蛋白的提??；⑤清晰的歷史背景和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可；⑥在無血清及化學(xué)限定培養(yǎng)基中快速穩(wěn)健地懸浮生長(zhǎng)。

CHO 細(xì)胞制備抗體藥物工藝成熟，抗體表達(dá)量高，批式培養(yǎng)約可達(dá) 1 g/L，流加補(bǔ)料培養(yǎng)可達(dá) 1 ～ 15 g/L（1987 年CHO 穩(wěn)定株表達(dá)量 0.1 g/L，2007 年 CHO 穩(wěn)定株表達(dá)量 5 g/L，2015 年 CHO 穩(wěn)定株表達(dá)量 10 g/L），單細(xì)胞分泌可達(dá) 10 ～ 90 pg/(cell·d)，如表 1 所示[8]。

CHO 細(xì)胞包含有CHO-DUXB11（或者 DUKX）、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S，以及近年來受到持續(xù)關(guān)注的 GS 基因敲除的 CHO 細(xì)胞，如 Merck/Sigma Aldrich 公司的CHOZN，Lonza 的 CHO K1 SV/ GS-KO，Horizon 公司用 rAAV 技術(shù)敲除的 CHO 細(xì)胞，但它們都來源于共同的祖先，CHO 細(xì)胞發(fā)展歷程如圖 2 所示[9]。

Reinhart 等[10]比較了 CHO-K1（ATCC CCL-61）、CHO-DG44（Life Technologies）、CHO-S（Life Technologies）三種細(xì)胞表達(dá)同一株抗體，結(jié)果表明，使用同一培養(yǎng)基進(jìn)行流加補(bǔ)料培養(yǎng)，CHO-DG44 表達(dá)量 670 mg/L，優(yōu)于 CHO-K1 表達(dá)量 460 mg/L，優(yōu)于 CHO-S 表達(dá)量 370 mg/L，進(jìn)行灌流培養(yǎng)時(shí)，CHO-K1 表達(dá)量?jī)?yōu)于 CHO-DG44，CHO-DG44 優(yōu)于 CHO-S，單細(xì)胞分泌量方面表現(xiàn)出了同樣趨勢(shì)，CHO-K1（13 ～ 16 pg/(cell·d) > CHO-DG44（4 ～ 5 pg/(cell·d) > CHO-S（2 pg/(cell·d)）。Reinhart 等[11]分別用兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)同一抗體的 CHO-K1、CHO-S 和 CHO-DG44 細(xì)胞，結(jié)果表明使用 ActiCHO P（GE Healthcare），表達(dá)量方面 CHO-DG44 表達(dá)量?jī)?yōu)于 CHO-K1，也優(yōu)于 CHO-S；但是使用 CD CHO（Life Technologies）培養(yǎng)基，表達(dá)量方面CHO-K1 細(xì)胞優(yōu)于 CHO-S 細(xì)胞，優(yōu)于 CHO-DG44 細(xì)胞，結(jié)果表明培養(yǎng)基對(duì)抗體表達(dá)量有 5 ～ 6 倍的影響。Rajendra 等[12]研究表明使用 PiggyBac 轉(zhuǎn)座子進(jìn)行重組抗體細(xì)胞池構(gòu)建篩選，細(xì)胞池表達(dá)量達(dá) 7.6 g/L，較對(duì)照高 2 ～ 10 倍，細(xì)胞池培養(yǎng)從搖瓶到 36 L 生物反應(yīng)器放大，產(chǎn)品質(zhì)量表現(xiàn)出較高的一致性，結(jié)果表明 piggyBac CHO 細(xì)胞池快速生產(chǎn)克級(jí)的治療性蛋白質(zhì)。

表1 CHO 細(xì)胞株表達(dá)量比較

注：n.a. 代表未獲得數(shù)據(jù)。

圖2 CHO 細(xì)胞常見細(xì)胞系

2.2 細(xì)胞系穩(wěn)定性

細(xì)胞系和工藝穩(wěn)定性對(duì)生物制藥的生產(chǎn)具有重要意義，多年來保證產(chǎn)品的高質(zhì)量是生物制藥生產(chǎn)的最重要原則。關(guān)于細(xì)胞系的穩(wěn)定性，分為幾類：①理想型：CHO 細(xì)胞進(jìn)行 100 次倍增周期結(jié)束時(shí)，蛋白表達(dá)量降低小于 15%；②穩(wěn)定型：CHO 細(xì)胞進(jìn)行 60 次倍增周期后，細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平維持在可接受范圍內(nèi)；③逐漸喪失型：CHO 細(xì)胞進(jìn)行少于 60 次倍增周期，細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平在多次傳代中顯示出可測(cè)量的降低或逐漸降低的趨勢(shì)；④突然降低型：細(xì)胞經(jīng)歷某次傳代后，細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平突然降低。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明有 8% ～ 63% 的細(xì)胞株存在不穩(wěn)定現(xiàn)象[13]，導(dǎo)致 CHO 細(xì)胞不穩(wěn)定性的原因主要有 CHO 基因組的固有不穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄沉默、基因/表型漂移等[14]。

2.3 細(xì)胞株改造

2.3.1 抗凋亡改造 細(xì)胞凋亡是影響活細(xì)胞密度和產(chǎn)量、質(zhì)量的關(guān)鍵因素。引起細(xì)胞凋亡的因素很多，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝廢物累積、不斷增加的滲透壓以及剪切力等。細(xì)胞凋亡受 Bcl-2 家族蛋白調(diào)節(jié)，包含抗凋亡 Bcl-2 樣蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-2）和促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bok、Bim、Bid、Bad、Puma 和 Noxa）。過表達(dá)抗凋亡因子 Bcl-2 樣蛋白可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，對(duì) Qp 影響不明確，差異性主要是由于克隆多樣性[15]。過表達(dá)凋亡因子 Bcl-2 樣蛋白同時(shí)加強(qiáng) Qp 增長(zhǎng)因子，如丁酸鈉、高滲透壓等，可明顯提升 CHO 細(xì)胞的外源蛋白表達(dá)[16]。

2.3.2 抗細(xì)胞自噬改造 細(xì)胞自噬，也被稱為 I 型程序性細(xì)胞死亡（program cell death，PCD)，是溶酶體介導(dǎo)的降解途徑中的一種代謝，與細(xì)胞凋亡（II 型 PCD）不同。有研究表明，在 CHO 細(xì)胞批式培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，出現(xiàn)由于細(xì)胞自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[17]。另外流加培養(yǎng)過程中通過添加補(bǔ)料和 pH 控制可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，過表達(dá) Bcl-xL 可以延緩由于細(xì)胞自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[18]。

2.3.3 細(xì)胞增殖改造 改造 CHO 細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)蛋白可以提高細(xì)胞生長(zhǎng)速率或者最大細(xì)胞密度。通過調(diào)節(jié)改造與細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 3、細(xì)胞周期蛋白 E、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子 E2F1 可提升細(xì)胞生長(zhǎng)速率或者最大細(xì)胞密度[19]。典型的致癌蛋白 c-myc在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，雷帕霉素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞分化等方面發(fā)揮著不同的作用，成功用于 CHO 細(xì)胞改造，提高細(xì)胞密度[20-21]。

2.3.4 代謝改造 CHO 細(xì)胞中氨和乳酸的積累是一個(gè)主要問題，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量有重要影響，這兩種有毒廢物是由能量來源谷氨酰胺和葡萄糖產(chǎn)生。對(duì)代謝相關(guān)蛋白進(jìn)行基因修飾可高效利用代謝物，如使用氨生成較少的底物谷氨酸可減少谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為氨，CHO 細(xì)胞表達(dá)谷氨酰胺合成酶（GS），GS 催化谷氨酸與氨反應(yīng)生成谷氨酰胺，結(jié)果代謝廢物氨的累積變少，同樣將尿素循環(huán)中的氨甲酰磷酸合成酶 I 和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酰酶引入 CHO 細(xì)胞，也可導(dǎo)致氨積累減少[22]。

有多種方法可以穩(wěn)定地從基因組中刪除基因或關(guān)閉其功能，如通過化學(xué)或輻射誘導(dǎo)隨機(jī)突變，或使用精確的基因組編輯方法。目前最新基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）、巨核酸酶、簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)和 RNAi 介導(dǎo)基因沉默[23]。

3 培養(yǎng)基

細(xì)胞培養(yǎng)基含有相似的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)組分，支持細(xì)胞增殖，包括水、碳酸、氮源、磷酸鹽、氨基酸、脂肪酸、維生素、微量元素、無機(jī)鹽和其他滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需求的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。合適濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以使細(xì)胞維持在需求的細(xì)胞密度，監(jiān)測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝速度可以進(jìn)行補(bǔ)料以維持細(xì)胞持續(xù)增長(zhǎng)。培養(yǎng)基種類多樣，現(xiàn)重點(diǎn)關(guān)注無血清、化學(xué)成分限定的、適合工業(yè)化生產(chǎn)的 CHO 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基優(yōu)化是提升表達(dá)量的其中一個(gè)關(guān)鍵因素，Huang 等[24]分別選擇 3 種基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CM1、CM2、CM3）和 4 種補(bǔ)料培養(yǎng)基（CF1、CF2、CF2a、CF2b），培養(yǎng) CHO DG44 細(xì)胞表達(dá)人 IgG 抗體，結(jié)果表明使用 CM3 培養(yǎng)基和 CF2b 補(bǔ)料表達(dá)量最高達(dá) 9800 mg/L，較使用 CM1 培養(yǎng)基和 CF1 補(bǔ)料表達(dá)量提升 2.3 倍。

3.1 能源物質(zhì)

葡萄糖是最主要的碳源和能源物質(zhì)，培養(yǎng)基中剩余約 0.5 g/L 葡萄糖時(shí)，細(xì)胞仍可維持較好的活率，但是由于 CHO 細(xì)胞的增殖速度和營(yíng)養(yǎng)消耗速率較快，在培養(yǎng)過程中葡萄糖的濃度最低要控制在 2 ～ 3 g/L。葡萄糖的消耗會(huì)造成丙酮酸和乳酸的累積，高濃度的乳酸會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。半乳糖是一種重要的葡萄糖替代物，當(dāng)培養(yǎng)基中含有葡萄糖和半乳糖時(shí)，細(xì)胞優(yōu)先消耗葡萄糖，之后轉(zhuǎn)變消耗半乳糖，可以減少乳酸堆積，進(jìn)而延遲細(xì)胞活率降低[25]。

谷氨酰胺也是一種常用的能源物質(zhì)，谷氨酰胺的缺乏會(huì)延遲細(xì)胞對(duì)數(shù)期的啟動(dòng)[26]。培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺，可提升細(xì)胞活率、降低乳酸代謝，但是谷氨酰胺代謝產(chǎn)生氨，高濃度的氨影響細(xì)胞生長(zhǎng)和其他氨基酸的代謝[27]。因此常用谷氨酰胺聚合物 GlutaMAX（Thermo）替代谷氨酰胺，谷氨酸和丙酮酸也可替代谷氨酰胺[28]，減少氨的產(chǎn)生。

3.2 氨基酸

氨基酸是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)組分，研究表明優(yōu)化培養(yǎng)基中氨基酸的種類及濃度，可以影響細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白分泌，影響抗體糖基化，可以使細(xì)胞密度提升 50%，融合蛋白分泌提升 25%[29]。依據(jù)細(xì)胞的代謝特點(diǎn)，應(yīng)用 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行培養(yǎng)基中氨基酸濃度的優(yōu)化，確定利于細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白分泌的關(guān)鍵氨基酸，使抗體分泌提升，但不影響抗體的質(zhì)量。

3.3 脂質(zhì)

脂類是生物膜的主要成分，可作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞能量來源和信號(hào)分子，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的關(guān)鍵組成部分。CHO 細(xì)胞自身可合成脂質(zhì)，但若在無血清培養(yǎng)基中補(bǔ)充脂質(zhì)，更有利于對(duì)細(xì)胞活力維持和產(chǎn)物糖基化。不同脂質(zhì)及脂質(zhì)前體對(duì) CHO 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響有很大的不同，培養(yǎng)基中脂質(zhì)補(bǔ)充劑的選擇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可產(chǎn)生顯著影響[30]。

磷脂是大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的主要成分，補(bǔ)充外源性磷脂，如磷脂酸和溶血磷脂酸，可能刺激化學(xué)成分限定無血清培養(yǎng)中 CHO 細(xì)胞生長(zhǎng)。外源性補(bǔ)充劑乙醇胺對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，效果與混合脂質(zhì)相當(dāng)[31]。脂肪酸和膽固醇在水中不易溶解或不穩(wěn)定，脂肪酸和膽固醇前體和類似物，更穩(wěn)定且更易溶解在培養(yǎng)基中，同樣可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。脂肪酸在培養(yǎng)基中發(fā)揮重要作用，培養(yǎng)基中的含量應(yīng)保持在相對(duì)較低的水平，因?yàn)楦邼舛鹊闹舅峥赡軐?dǎo)致 CHO 細(xì)胞的脂毒性[32]。

3.4 維生素

維生素作為輔酶或輔助因子信號(hào)，在信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及酶的抑制和激活中發(fā)揮重要作用。維生素的高還原能力可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷?；瘜W(xué)成分限定的培養(yǎng)基，都含有多種維生素及其衍生物，包括生物素、葉酸、肌醇、煙酰胺、膽堿、4-氨基苯甲酸、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和鈷胺素。研究表明在CHO 細(xì)胞培養(yǎng)中添加維生素，單抗產(chǎn)率提高 3 倍。多種維生素對(duì)熱、強(qiáng)光和長(zhǎng)期暴露在空氣中敏感，尤其是 CHO 培養(yǎng)基中常添加的維生素，抗壞血酸和生育酚易被空氣氧化，硫胺素、核黃素、鈷胺素和抗壞血酸對(duì)光敏感；硫胺和泛酸對(duì)熱敏感，需要對(duì)光和熱進(jìn)行保護(hù)，因此在培養(yǎng)基儲(chǔ)存期間，避光和低溫至關(guān)重要[33]。

3.5 微量元素

細(xì)胞培養(yǎng)基中微量元素的有效濃度通常非常低，甚至低于標(biāo)準(zhǔn)分析儀器的檢測(cè)閾值。然而它們發(fā)揮著重要作用，許多微量金屬元素對(duì)代謝途徑的調(diào)節(jié)以及某些酶信號(hào)的活性起著關(guān)鍵作用。在 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)中，銅缺乏可導(dǎo)致乳酸脫氫酶和其他線粒體酶下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致組織毒性；相對(duì)較高濃度的銅可以改變 CHO 細(xì)胞乳酸代謝，從乳酸產(chǎn)生到乳酸消耗，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)量，因此 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基中的銅濃度應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)表現(xiàn)和產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行調(diào)節(jié)[34-35]。鐵被廣泛認(rèn)為是化學(xué)成分限定培養(yǎng)基中的必要成分。鐵通過血紅素、線粒體氧化途徑在氧轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用[36]。在無血清培養(yǎng)基中，可添加重組轉(zhuǎn)鐵蛋白以提高鐵的穩(wěn)定性和攝取。小分子螯合劑如肌鈣酮、檸檬酸鹽和亞硒酸鹽，可作為轉(zhuǎn)鐵蛋白的廉價(jià)替代品。亞硒酸鹽、鐵和檸檬酸鹽在最佳濃度配比下，可提高鐵的吸收，促進(jìn) CHO 細(xì)胞在缺鐵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，若只有檸檬酸鐵而無亞硒酸鹽時(shí)，不能達(dá)到同樣效果。在化學(xué)成分限定和無蛋白 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基中，鋅是對(duì)單抗產(chǎn)量影響最大的微量元素之一，培養(yǎng)基中補(bǔ)鋅可使單克隆抗體產(chǎn)量提高 1.2 倍[37]。

除上述主要微量元素外，其他元素也會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品產(chǎn)量。在細(xì)胞培養(yǎng)基中，大多數(shù)微量元素濃度低于5 μmol/L。大多數(shù)培養(yǎng)基中都含有錳、鉬、硒和釩等常規(guī)細(xì)胞所需微量元素。其他微量元素，包括鍺、銣、鋯、鈷、鎳、錫和鉻等，在部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中也會(huì)添加。

3.6 無機(jī)鹽

無機(jī)鹽在 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基中起著重要的化學(xué)和生物學(xué)作用，包括維持細(xì)胞膜電位、滲透壓和緩沖作用，無機(jī)鹽離子包括鈉、鉀、鎂、鈣、氯化物、磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽和鐵硝酸鹽。常規(guī) CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基中，鈉離子與鉀離子的比值范圍為 20:1 ～ 40:1，也有報(bào)道鈉鉀比較低（6:1 ～ 8:1）的培養(yǎng)基或相對(duì)較高的鉀濃度有利于提高 CHO 細(xì)胞生長(zhǎng)能力和分泌能力[38]。培養(yǎng)基中鈣和鎂離子的濃度通常為 1 ～ 3 mmol/L 和 0.2 ～ 1 mmol/L。缺乏鈣和鎂會(huì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度過高也可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[39]。

無機(jī)鹽還可以控制培養(yǎng)基的滲透壓。Ozturk 和 Palsson[40]報(bào)道將滲透壓從 290 增加到 435 mOsm/kg，會(huì)降低雜交瘤細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)，但細(xì)胞比增殖率增加了兩倍以上，從而產(chǎn)生類似的最終抗體濃度。據(jù)報(bào)道，CHO 細(xì)胞滲透壓在 316 ～ 450 mOsm/kg 之間，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率隨著培養(yǎng)基滲透壓的增加而線性下降，滲透壓逐漸增加至 450 mOsm/kg 左右，可顯著提高 CHO 細(xì)胞過程中的比分泌速率和抗體產(chǎn)量[41]。

3.7 聚胺

聚胺是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的分子，在 DNA 合成和轉(zhuǎn)錄、核糖體功能、離子通道調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等多種代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，CHO 培養(yǎng)基含有外源性多胺，包括腐胺、亞精胺、精胺。腐胺是合成精胺和亞精胺的前體，而精胺和亞精胺在細(xì)胞中可以相互轉(zhuǎn)換。以前的研究表明，這些聚胺中的每一種都可以單獨(dú)提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和活力，精胺是最有效的[42]。多胺可通過多種途徑分解代謝產(chǎn)生氧化物種、醛類、丙烯醛和氨，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并最終影響細(xì)胞活力，因此在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充多胺應(yīng)控制在細(xì)胞毒性限度以下。

3.8 非營(yíng)養(yǎng)成分

CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基中存在一些非營(yíng)養(yǎng)成分，給細(xì)胞提供更穩(wěn)定的物理或化學(xué)環(huán)境，如緩沖劑、表面活性劑和消泡劑。緩沖液是細(xì)胞培養(yǎng)的重要組成部分。CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基中可添加有機(jī)兩性離子緩沖液 HEPE 等，在 7.2 ～ 7.4 的 pH 范圍內(nèi)提供強(qiáng)大的緩沖能力，提高 pH 穩(wěn)定性。此外培養(yǎng)基中的磷酸鹽離子也是提供緩沖能力的主要來源。

Pluronic F-68 是培養(yǎng)基中常用的一種表面活性劑，可以保護(hù)細(xì)胞免受泡沫破裂、機(jī)械攪拌等引起的損傷。Pluronic F-68 可通過一種或多種機(jī)制保護(hù)細(xì)胞，包括在細(xì)胞膜上形成保護(hù)層，從而降低疏水性，穩(wěn)定生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)物頂部的泡沫層，或通過并入細(xì)胞膜加強(qiáng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性。消泡劑是一種疏水性很強(qiáng)的表面活性劑，其表面黏度很低，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械剪切，并防止生物反應(yīng)器和排氣過濾器堵塞時(shí)潛在的泡沫堆積。消泡劑可直接添加到生產(chǎn)培養(yǎng)基中或在生產(chǎn)過程中按需添加。消泡劑可以是油基或有機(jī)硅基，根據(jù)消泡機(jī)制可分為快消泡劑和慢消泡劑?？煜輨┩ǔＪ撬畱腋∫夯蛉闋钜?，其中乳狀液中的顆?；蛞旱慰焖龠M(jìn)入泡沫膜以破泡；油基消泡劑消除泡沫作用更慢。在 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)中多使用硅酮基消泡劑，如消泡劑 C，因硅酮基消泡效率高、毒性小而得到廣泛應(yīng)用[43]。

4 細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備和工藝

哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的設(shè)計(jì)依據(jù)主要依賴于攪拌生物反應(yīng)器，自 20 世紀(jì) 80 年代建立攪拌式 CHO 生物反應(yīng)器技術(shù)以來，生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)更注重向工業(yè)化、自動(dòng)化和智能化方向發(fā)展。培養(yǎng)工藝以補(bǔ)料分批培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)最常見。補(bǔ)料策略可以通過一個(gè)或多個(gè)補(bǔ)料溶液從單次到多次變化，補(bǔ)料成分包括營(yíng)養(yǎng)濃縮物、葡萄糖、微量元素和維生素或其他培養(yǎng)基組分。這種生產(chǎn)方式工藝簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)靈活、易于擴(kuò)展和轉(zhuǎn)移，且便于優(yōu)化產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量參數(shù)，成為當(dāng)今生物技術(shù)行業(yè)的主力軍，同時(shí)涌現(xiàn)了多個(gè)生產(chǎn)外包組織（contact manufacture organization，CMO）。灌流培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)是高容量輸出，因?yàn)榈湫偷妮^高細(xì)胞密度和較短的產(chǎn)品停留時(shí)間使得灌流培養(yǎng)技術(shù)對(duì)敏感產(chǎn)品特別有吸引力，例如凝血因子或其他易被蛋白水解或其他易降解不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)[44]；對(duì)于相對(duì)穩(wěn)定的產(chǎn)品，分批補(bǔ)料處理已成為工業(yè)規(guī)模的主流生產(chǎn)技術(shù)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物反應(yīng)器的大小從數(shù)百升到25 000 L 不等，取決于臨床供應(yīng)需求，商業(yè)和工業(yè)所需的生產(chǎn)規(guī)模，用于工藝開發(fā)、表征和驗(yàn)證研究的小型實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器的體積通常為 2 ～ 5 L。這 10 000 倍的放大比例是傳統(tǒng)攪拌生物反應(yīng)器的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，能夠有效地測(cè)試包括復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)在內(nèi)的許多實(shí)驗(yàn)條件，放大/縮小模型原則現(xiàn)在已經(jīng)很成熟，許多公司已經(jīng)將多個(gè)流程從小型臨床轉(zhuǎn)移到大型工業(yè)設(shè)施[45]。生物反應(yīng)器現(xiàn)常用一次性生物反應(yīng)器，其生產(chǎn)規(guī)模可達(dá) 2000 L，但它較難達(dá)到許多常見的大型工業(yè)化設(shè)備的容量（如 25 000 L），常用于臨床或小規(guī)模（通常是單一產(chǎn)品）商業(yè)生產(chǎn)。Xing 等[46]認(rèn)為放大過程中混合時(shí)間、氧傳質(zhì)和二氧化碳去除等因素至關(guān)重要，與 5 L 和 20 L 等實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器相比，5000 L生物反應(yīng)器具有較低的氧傳遞系數(shù)、較長(zhǎng)的混合時(shí)間和較低的二氧化碳去除率，提高底部空氣噴射率比增加輸入功率更有利于氧的傳遞和二氧化碳的去除。在 5000 L 反應(yīng)器放大的過程中，混合時(shí)間和二氧化碳去除相關(guān)的工藝參數(shù)需要優(yōu)化，以降低工藝規(guī)模放大過程的風(fēng)險(xiǎn)。Clincke 等[47]使用一次性 wave 反應(yīng)器比較了“經(jīng)典”切向流過濾（TFF）和交替切向流系統(tǒng)（ATF）設(shè)備灌流培養(yǎng) CHO 細(xì)胞，培養(yǎng)周期 20 d，最大細(xì)胞密度可達(dá)到 2.14 × 108個(gè)/ml，使用 TFF 時(shí)細(xì)胞密度受到中空膜容量和 pCO2水平的限制，使用 ATF 時(shí)由于泵容量限制無法拉動(dòng)高黏度液體，整體 TFF 系統(tǒng)可以達(dá)到更高的細(xì)胞密度。TFF 入口壓力與黏度高度相關(guān)，據(jù)此建立了壓力模型，為 TFF 和 ATF 的中空纖維灌流方案設(shè)計(jì)提供了有用的工具，培養(yǎng)工藝受黏度等物理限制較大，根據(jù)對(duì)目前模型分析，建議灌流培養(yǎng)細(xì)胞密度應(yīng)低于 1.46 × 108個(gè)/ml。

5 展望

全球抗體藥物發(fā)展迅速，市場(chǎng)規(guī)模巨大，中國(guó)抗體藥物行業(yè)面臨很好的時(shí)機(jī)，包括國(guó)家政策支持、藥監(jiān)局改革，還有巨大的市場(chǎng)潛力。中國(guó)企業(yè)也投入大量資金進(jìn)行研發(fā)，工業(yè)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到一個(gè)成熟的階段，分批補(bǔ)料工藝生產(chǎn)規(guī)模高達(dá) 25 000 L，表達(dá)量≥ 10 g/L。如何快速研發(fā)、提高產(chǎn)量、降低成本仍是企業(yè)亟需關(guān)注解決的問題，從而為抗體藥的未來發(fā)展提供更多空間。

[1] O'flaherty R, Bergin A, Flampouri E, et al. Mammalian cell culture for production of recombinant proteins: a review of the critical steps in their biomanufacturing. Biotechnol Adv, 2020, 43:107552.

[2] An C, Mao XY. Strategy for design and optimization of expression vector for therapeutic monoclonal antibody. Chin J Biol, 2014, 27(4): 568-573. (in Chinese)

安晨, 毛曉燕. 治療性單克隆抗體表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與優(yōu)化策略. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2014, 27(4):568-573.

[3] Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, et al. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production. Eur J Pharm Biopharm, 2010, 74(2):127-138.

[4] Bayat H, Hossienzadeh S, EPourmaleki E, et al. Evaluation of different vector design strategies for the expression of recombinant monoclonal antibody in CHO cells. Prep Biochem, 2018, 48(2):160- 164.

[5] Yeo JHM, Mariati, Yang Y, et al. An IRES-mediated tricistronic vector for efficient generation of stable, high-level monoclonal antibody producing CHO DG44 cell lines. Methods Mol Biol, 2018, 1827: 335-349.

[6] Yang L. Study on site-specific integration and expression of human serum albumin in CHO-K1 cell genome. Wuxi: Jiangnan University, 2020. (in Chinese)

楊蕾. 在 CHO-K1 細(xì)胞基因組內(nèi)定點(diǎn)整合表達(dá)人血清白蛋白的研究. 無錫: 江南大學(xué), 2020.

[7] Jayapal KP, Wlaschin KF, Hu WS, et al. Recombinant protein therapeutics from CHO cells - 20 years and counting. Chem Eng Prog, 2007, 103(10):40-47.

[8] Kunert R, Reinhart D. Advances in recombinant antibody manufacturing. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(8):3451-3461.

[9] Wurm FM, Hacker D. First CHO genome. Nat Biotechnol, 2011, 29(8):718-720.

[10] Reinhart D, Damjanovic L, Kaisermayer C, et al. Bioprocessing of recombinant CHO-K1, CHO-DG44, and CHO-S: CHO expression hosts favor either mAb production or biomass synthesis. Biotechnol J, 2018, 14(3):e1700686.

[11] Reinhart D, Damjanovic L, Sommeregger W, et al. Influence of cell culture media and feed supplements on cell metabolism and quality of IgG produced in CHO-K1, CHO-S, and CHO-DG44. BMC Proc, 2015, 9(Suppl 9):36.

[12] Rajendra Y, Balasubramanian S, Peery RB, et al. Bioreactor scale up and protein product quality characterization of piggyBac transposon derived CHO pools. Biotechnol Prog, 2017, 33(2):534-540.

[13] Leonard M, Hone M, Cecilia Cooley C, et al. Managing cell line instability and its impact during cell line development. BioPharm Int, 2009, 2009 Suppl(4):1-4.

[14] Dahodwala H, Lee KH. The fifickle CHO: a review of the causes, implications, and potential alleviation of the CHO cell line instability problem. Curr Opin Biotechnol, 2019, 60:128-137.

[15] Chiang GG, Sisk WP. Bcl-xL mediates increased production of humanized monoclonal antibodies in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng, 2005, 91(7):779-792.

[16] Kim YG, Kim JY, Lee GM. Effect of XIAP overexpression on sodium butyrate-induced apoptosis in recombinant Chinese hamster ovary cells producing erythropoietin. J Biotechnol, 2009, 144(4):299-303.

[17] Hwang SO, Lee GM. Nutrient deprivation induces autophagy as well as apoptosis in Chinese hamster ovary cell culture. Biotechnol Bioeng, 2010, 99(3):678-685.

[18] Hwang SO, Lee GM. Effect of Akt overexpression on programmed cell death in antibody-producing Chinese hamster ovary cells.

J Biotechnol, 2009, 139(1):89-94.

[19] Majors BS, Arden N, Oyler GA, et al. E2F-1 overexpression increases viable cell density in batch cultures of Chinese hamster ovary cells.

J Biotechnol, 2008, 138(3-4):103-106.

[20] Kuystermans D, Al-Rubeai M. cMyc increases cell number through uncoupling of cell division from cell size in CHO cells. BMC Biotechnol, 2009, 9:76.

[21] Dreesen IA, Fussenegger M. Ectopic expression of human mTOR increases viability, robustness, cell size, proliferation, and antibody production of Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(4):853-866.

[22] Park H, Kim IH, Kim IY, et al. Expression of carbamoyl phosphate synthetase I and ornithine transcarbamoylase genes in Chinese hamster ovary dhfr-cells decreases accumulation of ammonium ion in culture media. J Biotechnol, 2000, 81(2-3):129-140.

[23] Cho SW, Ki S, Kim JM, et al. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol, 2013, 31(3):230-232.

[24] Huang YM, Hu WW, Rustandi E, et al. Maximizing productivity of CHO cell-based fed-batch culture using chemically defined media conditions and typical manufacturing equipment. Biotechnol Prog, 2010, 26(5):1400-1410.

[25] Wilkens CA, Altamirano C, Gerdtzen ZP. Comparative metabolic analysis of lactate for CHO cells in glucose and galactose. Biotechnol Bioprocess Eng, 2011, 16(4):714-724.

[26] Bort JA, Stern B, Borth N. CHO-K1 host cells adapted to growth in glutamine-free medium by FACS-assisted evolution. Biotechnol J, 2010, 5(10):1090-1097.

[27] Quek LE, Dietmair S, Kr?mer JO, et al. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng, 2010, 12(2):161-171.

[28] Altamirano C, Paredes C, Cairó JJ, et al. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnol Prog, 2000, 16(1):69-75.

[29] Xing Z, Kenty B, Koyrakh I, et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Proc Biochem, 2011, 46(7):1423-1429.

[30] Torkashvand F, Vaziri B, Maleknia S, et al. Designed amino acid feed in improvement of production and quality targets of a therapeutic monoclonal antibody. PLoS One, 2015, 10(10):e0140597.

[31] Zhang H, Wang H, Liu M, et al. Rational development of a serum-free medium and fed-batch process for a GS-CHO cell line expressing recombinant antibody. Cytotechnol, 2013, 65(3):363-378.

[32] Listenberger LL, Han X, Lewis SE, et al. Triglyceride accumulation protects against fatty acid-induced lipotoxicity. Proc Natl Acad Sci

U S A, 2003, 100(6):3077-3082.

[33] Yao T, Asayama Y. Animal-cell culture media: History, characteristics, and current issues. Reprod Med Biol, 2017, 16(2):99-117.

[34] Yuk IH, Zhang JD, Ebeling M, et al. Effects of copper on CHO cells: insights from gene expression analyses. Biotechnol Prog, 2014, 30(2):429-442.

[35] Yuk IH, Russell S, Tang Y, et al. Effects of copper on CHO cells: cellular requirements and product quality considerations. Biotechnol Prog, 2015, 31(1):226-238.

[36] Halliwell B. Cell culture, oxidative stress, and antioxidants: avoiding pitfalls. Biom J, 2014, 37(3):99-105.

[37] Kim BG, Park HW. High zinc ion supplementation of more than 30 μM can increase monoclonal antibody production in recom binant Chinese hamster ovary DG44 cell culture. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(5):2163-2170.

[38] Yang Z, Xiong HR. Culture conditions and types of growth media for mammalian cells//Ceccherini-Nelli L. Biomedical tissue culture. London: IntechOpen Limited, 2012.

[39] Feng H, Guo L, Gao H, et al. Defificiency of calcium and magnesium induces apoptosis via scavenger receptor BI. Life Sci, 2011, 88(13-14):606-612.

[40] Ozturk SS, Palsson BO. Effect of medium osmolarity on hybridoma growth, metabolism, and antibody production. Biotechnol Bioeng, 1991, 37(10):989-993.

[41] Zhu MM, Goyal A, Rank DL, et al. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of CHO cells and production of antibody-fusion protein B1: a case study. Biotechnol Prog, 2005, 21(1):70-77.

[42] Pegg AE. Functions of polyamines in mammals. J Biol Chem, 2016, 291(29):14904-14912.

[43] Ozturk SS. Equipment for large-scale mammalian cell culture. Adv Biochem Eng Biotechnol, 2014, 139:69-92.

[44] Meuwly F, Weber U, Ziegler T. Conversion of a CHO cell culture process from perfusion to fed batch technology without altering product quality. J Biotechnol, 2006, 123(1):106-116.

[45] Pohlscheidt M, Corrales M, Charanyia S, et al. Avoiding pitfalls during technology transfer of cell culture manufacturing processes in the pharmaceutical industry-mitigating risk and optimizing performance. Pharm Outsour, 2013, 14:34-48.

[46] Xing Z, Kenty BM, Li ZJ, et al. Scale-up analysis for a CHO cell culture process in large-scale bioreactors. Biotechno Bioeng, 2010, 103(4):733-746.

[47] Clincke MF, ?lleryd C, Zhang Y, et al. Very high density of CHO cells in perfusion by ATF or TFF in WAVE bioreactor?. Part I. Effect of the cell density on the process. Biotechnol Prog, 2013, 29(3):754-767.

趙巧輝，Email：zhaoqiaohui@autobio.com.cn

2021-02-22

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.010