史北辰，馮茜，韓強(qiáng)，陳浩東，孫越，周國(guó)棟，金媛媛，張志斐，楊兆勇

·論著·

多肽UNAM的生物合成及其在DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

史北辰*，馮茜*，韓強(qiáng)，陳浩東，孫越，周國(guó)棟，金媛媛，張志斐，楊兆勇

063210 唐山，華北理工大學(xué)藥學(xué)院（史北辰、韓強(qiáng)、陳浩東、孫越、張志斐）；255067 山東，淄博市第四人民醫(yī)院內(nèi)科（馮茜），腫瘤科（周國(guó)棟）；100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所代謝工程室（金媛媛、楊兆勇）

制備尿苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸（UNAM），并研究其提升 DC-CIK 細(xì)胞識(shí)別及殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。通過(guò)設(shè)計(jì)體外酶促反應(yīng)合成多肽 UNAM 的路線，構(gòu)建體外酶促反應(yīng)體系，按照UNAM 的路線圖合成多肽產(chǎn)物，并采用制備液相純化和收集最終產(chǎn)物。使用常規(guī)培養(yǎng)方法和添加 UNAM 的方法分別對(duì) DC-CIK 細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)后的 DC-CIK 細(xì)胞對(duì)荷瘤小鼠的治療效果。利用大腸桿菌異源表達(dá)系統(tǒng)，獲得了 UNAM 生物合成途徑中的 NahK、GlmU、MurA 和 MurB 4 個(gè)酶，并成功合成了分枝桿菌細(xì)胞壁肽聚糖生物合成中的中間產(chǎn)物 UNAM。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，UNAM-DC-CIK 細(xì)胞對(duì)荷瘤小鼠的治療效果比常規(guī)方法的 DC-CIK 細(xì)胞更好，其帶瘤生存期更長(zhǎng)（43 d），優(yōu)于DC-CIK 治療組（38 d）和對(duì)照組（25 d）。UNAM 可以提升 DC-CIK 細(xì)胞的增殖能力和對(duì)腫瘤的殺傷能力。

多肽 UNAM； 生物合成； DC-CIK 細(xì)胞； 抗腫瘤

隨著環(huán)境污染等問(wèn)題的加劇，惡性腫瘤對(duì)人們生命健康的影響日益嚴(yán)峻，其發(fā)病率也連年上升，甚至在中國(guó)逐漸成為健康的第一殺手[1]。如何治療惡性腫瘤，改善腫瘤患者的生活狀態(tài)已經(jīng)成為科研熱點(diǎn)。

腫瘤免疫療法以免疫學(xué)基本原理為依據(jù)，以人為干預(yù)治療的方式，通過(guò)使用免疫細(xì)胞、單克隆抗體、癌癥疫苗等來(lái)提升人體內(nèi)的腫瘤-免疫循環(huán)反應(yīng)（一方面提升腫瘤細(xì)胞的免疫原性，另一方面也對(duì)人體的抗病能力、對(duì)腫瘤細(xì)胞的鑒別敏感性以及殺傷活性有一定的提高），增強(qiáng)了人體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用，最終達(dá)到遏制腫瘤細(xì)胞繁殖、擴(kuò)散，甚至消滅腫瘤的治療方法[2-4]。其中，以免疫細(xì)胞為治療手段的方式已經(jīng)開(kāi)展了很多研究。作為重點(diǎn)研究對(duì)象的免疫細(xì)胞種類包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer，CIK）、樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）等[5]。

CIK 細(xì)胞是指將提取得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）在體外進(jìn)行培養(yǎng)，在加入包括 IL-1、IL-2、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等一系列的細(xì)胞因子后，誘導(dǎo)生成的多種類的混合細(xì)胞群體[6-7]。在這個(gè)混合細(xì)胞群體中，CD3+CD56+細(xì)胞亞群與 CD3+CD8+細(xì)胞亞群所擁有的細(xì)胞數(shù)量及占比處于較高水平，正是這些免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了強(qiáng)大的殺傷能力[8]。甚至，有研究發(fā)現(xiàn) DC 細(xì)胞可以促進(jìn)CIK 細(xì)胞的抗腫瘤作用[9-11]。然而，這些細(xì)胞體外制備的主要限制因素是誘導(dǎo)效果顯著的細(xì)胞因子發(fā)掘，并用其提高免疫細(xì)胞的增殖效率和殺傷活性[12-15]。

尿苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸（UDP-N- acetylmuramic acid，UDP-MurNAc/UNAM）是在合成肽聚糖過(guò)程中的一類重要化合物，其主要作用是參與細(xì)胞壁的合成與調(diào)控。在大多數(shù)的真菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量占據(jù)了較大比例，真菌細(xì)胞壁不但能使真菌保持正常的細(xì)胞形態(tài)，維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡，而且在真菌的生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程中能夠發(fā)揮一定的作用。根據(jù)這一研究結(jié)果，我們通過(guò)查閱文獻(xiàn)，最終通過(guò)體外生物合成的方法獲取了多肽 UNAM，并選用 UNAM 作為誘導(dǎo)物，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng) DC-CIK 細(xì)胞的研究，以期通過(guò)該多肽類化合物提升細(xì)胞活性，改善細(xì)胞識(shí)別以及殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 表達(dá)菌株BL21 (DE3) 和表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a(+) 均購(gòu)自美國(guó) Novagen 公司；Co2+-NTA 填料購(gòu)自 Takara（中國(guó)）公司；30 K 超濾濃縮管購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司；HiTrap Q HP 購(gòu)自美國(guó) GE Healthcare Life 公司；卡那霉素（Kan）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自上海生物工程有限公司；標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16 細(xì)胞和六周齡的雄性清潔級(jí)近交系C57BL/6 小鼠[體重（20 ± 2）g]均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)已有的分枝桿菌中細(xì)胞壁肽聚糖合成酶中 NahK、GlmU、MurA 和MurB 的堿基序列，通過(guò)引物設(shè)計(jì)，經(jīng) PCR 擴(kuò)增和H I/d III 雙酶切處理后，分別連入 pET-28a(+) 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。引物序列分別為GlmU-F：GGAATTCCATATGACGTTTCCTGGTGACACCGCGG，GlmU-R：CCGCTCGAGTCACGGT GTCTGATCAGCGTCGGGT；MurA-F：GGAATTC CATATGGTGGCCGAGCGTTTCGTCGTGACTG，MurA-R：CCGCTCGAGCTAACAGCATACCCGT TCGATCTCG；MurB-F：GGAATTCCATATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGC，MurB-R：CCGCTCGAGCTACAACATGCAGCCGATCAGCACG；NahK-F：GGAATTCCATATGAACCGTACCCTGAC CCGCGAAC，NahK-R：CCGCTCGAGTCAGATAAAGCGCGCGGATACCGAG。

1.2.2 蛋白表達(dá)與純化 將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21 (DE3) 表達(dá)菌株，接種于 3 L 含 50 μg/ml 卡那霉素、30 μg/ml 四環(huán)素和氯霉素的 LB 培養(yǎng)基中。37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至600= 0.8 ～ 1.0，加入 1 mol/L IPTG 至終濃度為 0.5 mmol/L，在18 ℃、200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 12 h。用緩沖液 lysis buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 7.4）重懸菌體，利用高壓均質(zhì)機(jī)破碎，4 ℃、18 000 r/min 條件下離心40 min，收集上清后勻速緩慢地加入已平衡好的 Co2+-NTA 柱，再用 washing buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.4）5 倍柱體積沖洗，最后用 elution buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 7.4）洗脫目的蛋白。目的蛋白除鹽后，上樣于弱陰離子交換柱 HiTrapDEAE HP 進(jìn)行層析純化，利用洗脫液（20 mmol/L Tris，pH 8.0，2 mol/L NaCl）進(jìn)行梯度洗脫，收集出峰樣品。經(jīng) SDS-PAGE 檢測(cè)后將目的蛋白用 30 K 超濾濃縮管進(jìn)行脫鹽濃縮后備用。

1.2.3 體外酶促反應(yīng)體系的構(gòu)建 配制反應(yīng)體系中的緩沖液，10 ml 的緩沖溶液包含 50 mmol/L Tris-HCl（pH = 8.0），10 mmol/L MgCl2，0.1 mmol GlcNAc，0.12 mmol ATP，0.12 mol UTP，0.5 mmol PEP，0.1 mmol NADPH 和 2 mmol 葡萄糖，然后添加 5 mg NahK、5 mg GlmU、5 mg MurA、5 mg MurB，在室溫 N2下反應(yīng) 2 h，加入 5 ml 氯仿在 14 000 r/min 下離心 20 min，將上清液真空冷凍濃縮，得到白色粉末。將白色粉末用 1 ml 水溶解后用制備液相制備。液相過(guò)程需要使用 A 和 B 溶液，A 溶液為含有 40 mmol/L H3PO4的 2.5% MeOH（用 TEA 調(diào)整 pH 為6.5），B 溶液為含有 40 mmol/L H3PO4的 20% MeOH（用 TEA 調(diào)整 pH 為6.5），液相方法為：0 ～ 4 min 使用 100% A；4 ～ 35 min 使用 100% B；35 ～ 37 min 使用 100% A。

1.2.4 UNAM-DC-CIK 與 DC-CIK 細(xì)胞的培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠，取鼠脾臟，去包膜后切剪成大小約 0.2 cm × 0.2 cm 的脾片，置于含RPMI 1640 培養(yǎng)液的平皿中碾磨。200 目網(wǎng)篩過(guò)濾獲得細(xì)胞懸液，以 Ficoll-Hypaque 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞。用RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至 1 × 106/ml 并轉(zhuǎn)至 T75 培養(yǎng)瓶中，置 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 h 后，可以看到培養(yǎng)瓶中有兩類生長(zhǎng)方式不同的細(xì)胞：一類貼壁生長(zhǎng)，為 DC 細(xì)胞；另一類懸浮生長(zhǎng)，為 CIK 細(xì)胞。分離 DC 細(xì)胞和 CIK 細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。①DC 細(xì)胞培養(yǎng)：第 1 天，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中補(bǔ)入 10%小鼠自體血漿、IL-4 400 UI/ml、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）800 UI/ml；第 3 天，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并補(bǔ)充一定量培養(yǎng)基；第 5 天，補(bǔ)入 500 U/ml TNF-a 從而誘導(dǎo) DC 細(xì)胞的成熟。細(xì)胞培養(yǎng)到第7 ～ 8 天，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1.0 × 109個(gè)，活性超過(guò) 90%時(shí)，開(kāi)始收集 DC 細(xì)胞。②CIK 細(xì)胞培養(yǎng)：第 1 天，用細(xì)胞培養(yǎng)基，10%自體血漿將細(xì)胞充分混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并添加 IFN-γ 1000 U/ml，最終將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞濃度調(diào)整為 2.0 × 106個(gè)/ml，將其放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；第 2 天向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充 IL-2 1000 U/ml、IL-lα 100 U/ml、抗人 CD3 單抗 50 ng/ml；之后每?jī)商爝M(jìn)行一次補(bǔ)液（包括 10%自體血漿），細(xì)胞培養(yǎng)至 14 d 左右，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示數(shù)量達(dá)到 1.0 × 109個(gè)，細(xì)胞活性超過(guò) 90%時(shí)，說(shuō)明 CIK 細(xì)胞培養(yǎng)成熟。③DC-CIK 細(xì)胞共培養(yǎng)：將最終收集到的 DC 與 CIK 培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞按 1:10 的數(shù)量比進(jìn)行混合共培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，及時(shí)補(bǔ)充含有 IL-2 1000 U/ml 的培養(yǎng)基。UNAM-DC-CIK 細(xì)胞培養(yǎng)組在常規(guī) DC-CIK 培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，在 DC 與 CIK 細(xì)胞混合的同時(shí)加入終濃度為 50 μg/ml 的 UNAM。5 ～ 7 d 后，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量為 1.0 × 1010個(gè)，活性超過(guò) 90%時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)成熟。

1.2.5 UNAM-DC-CIK 細(xì)胞與常規(guī)誘導(dǎo)的 DC-CIK 細(xì)胞的增殖特性 分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第 3、5、7 天獲取 2 × 濃縮的 UNAM-DC-CIK 細(xì)胞液和 2 × 濃縮的常規(guī)誘導(dǎo)的 DC-CIK 細(xì)胞液。將前者設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，后者設(shè)為對(duì)照組。并采用 MTT 法檢測(cè)其570值，每組進(jìn)行 3 次檢測(cè)。

1.2.6 UNAM-DC-CIK 與 DC-CIK 細(xì)胞對(duì)荷瘤小鼠的治療效果 復(fù)蘇小鼠黑色素瘤 B16 細(xì)胞株，在 C57 小鼠的腋下接種B16 細(xì)胞，每只注射約 2.5 × 106個(gè)，共 30 只，隨機(jī)分為 3 組；從第 3 天起，每日腹腔注射誘導(dǎo) 7 d 的 UNAM-DC-CIK 細(xì)胞和 DC-CIK 細(xì)胞，共 5 次，每次每只注射 1 × 106個(gè)/0.5 ml，相應(yīng)地，每次向空白對(duì)照組小鼠體內(nèi)注射生理鹽水 0.5 ml。

2 結(jié)果

2.1 體外生物合成多肽UNAM

通過(guò)大量文獻(xiàn)的查閱，我們?cè)O(shè)計(jì)了圖1 所示的體外酶促反應(yīng)合成多肽 UNAM 的路線圖。之后，根據(jù)分枝桿菌中細(xì)胞壁肽聚糖合成酶中 NahK、GlmU、MurA 和 MurB 4 個(gè)酶的堿基序列，將擴(kuò)增后的 4 種目的基因分別與 pET28 載體相連接，從而完成表達(dá)載體的構(gòu)建（圖 2）。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL21 內(nèi)，經(jīng)過(guò)菌株培養(yǎng)、分離、純化，并用 SDS-PAGE 進(jìn)行分析確定得到的蛋白為目的蛋白（圖 3）。通過(guò)構(gòu)建體外酶促反應(yīng)體系，在配置反應(yīng)溶液與目的酶混合后，按照 UNAM 的路線圖最終合成多肽產(chǎn)物。多肽產(chǎn)物需要制備液相進(jìn)行處理，液相結(jié)果如圖 4 所示，UNAM 的檢測(cè)波長(zhǎng)是260 nm，出峰時(shí)間為 8.086 min，收集此出峰時(shí)間樣品，將制備后的樣品真空冷凍濃縮后所得到白色粉末即為 UNAM，并通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)一步驗(yàn)證（圖 5）。

圖1 UNAM 的合成路徑

Figure 1 Synthesis path of UNAM

圖2 4 種酶的重組構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒

Figure 2 Recombination of four enzymes to construct expression plasmids

2.2 UNAM-DC-CIK 與DC-CIK 細(xì)胞的增殖活性

通過(guò)研究培養(yǎng)天數(shù)對(duì)UNAM誘導(dǎo)的 CIK 細(xì)胞數(shù)量的影響，評(píng)價(jià)兩種細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果表明，培養(yǎng)第 3、5、7 天，UNAM-DC-CIK 的值分別為 0.40、0.71、2.12；DC-CIK 的值分別為 0.40、0.61、1.79（圖 6）。說(shuō)明經(jīng) UNAM 誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞 UNAM-DC-CIK 相較于 DC-CIK 細(xì)胞具有更高的增殖能力，而且，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，UNAM-DC-CIK 的增殖速度相較于 DC-CIK 細(xì)胞的增殖速度增長(zhǎng)更快。

1：NahK；2：GlmU；3：MurA；4：MurB

Figure 3 SDS-PAGE gel image ofhost expressing four enzymes

2.3 UNAM-DC-CIK 與DC-CIK 細(xì)胞對(duì)荷瘤小鼠的治療效果

通過(guò)研究 UNAM-DC-CIK 與 DC-CIK 細(xì)胞治療對(duì)荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響，評(píng)價(jià)兩種細(xì)胞的治療效果。結(jié)果如圖 7 所示，UNAM-DC-CIK 與 DC-CIK 均能夠緩解腫瘤對(duì)小鼠的損害，延長(zhǎng)小鼠的壽命。其中 UNAM-DC-CIK 治療組的生存時(shí)間最長(zhǎng)為 43 d，DC-CIK 治療組的生存時(shí)間為 38 d，對(duì)照組的生存時(shí)間為 25 d。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，UNAM-DC-CIK 相較于 DC-CIK，在治療小鼠腫瘤、延長(zhǎng)小鼠壽命上，效果更好。

圖4 UNAM 制備樣品液相圖

Figure 4 Liquid phase diagram of UNAM preparation sample

圖5 UNAM 質(zhì)譜驗(yàn)證圖

Figure 5 UNAM mass spectrum verification diagram

圖6 UNAM-DC-CIK 細(xì)胞和DC-CIK 細(xì)胞的增殖活性（*P < 0.05，ns沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）

Figure 6 The proliferation activity of UNAM-DC-CIK cells and DC-CIK cells (*< 0.05,nsno statistical significance)

圖7 UNAM-DC-CIK 細(xì)胞和DC-CIK 細(xì)胞的對(duì)小鼠生存期的影響（*P < 0.05，***P < 0.001）

Figure 7 The effect of UNAM-DC-CIK cells and DC-CIK cells on the survival of mice (*< 0.05,***< 0.001)

3 討論

當(dāng)前利用自體 CAR-T、DC-CIK 治療腫瘤患者的臨床研究陸續(xù)進(jìn)行，CAR-T 在培養(yǎng)過(guò)程中需要進(jìn)行繁瑣的基因編程，這限制了它的廣泛應(yīng)用。并且在應(yīng)用 CAR-T 治療的過(guò)程中極易出現(xiàn)治療相關(guān)不良事件，如細(xì)胞因子風(fēng)暴。與 CAR-T 相比，DC-CIK 培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便，而且在治療過(guò)程中患者幾乎無(wú)不良事件。由于 DC-CIK 是通過(guò)非 MHC依賴的方式發(fā)揮免疫作用，在面對(duì)那些免疫原性較低的腫瘤時(shí)，可以發(fā)揮更好的治療效果。此外有些化療藥物可以改變腫瘤微環(huán)境，增加腫瘤抗原暴露，或減少腫瘤對(duì)浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞的接觸，因此常用來(lái)與 DC-CIK 共同治療腫瘤患者，以發(fā)揮更好的治療作用。

UNAM 是合成肽聚糖過(guò)程中的一個(gè)重要中間產(chǎn)物，參與細(xì)胞壁的合成與調(diào)控。肽聚糖作為大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的重要組成，是維持細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)和滲透壓平衡的重要基礎(chǔ)。本文利用大腸桿菌異源表達(dá)系統(tǒng)，異源表達(dá)獲得了 UNAM 生物合成途徑中的 NahK、GlmU、MurA 和 MurB 4 個(gè)酶。采用體外酶促反應(yīng)，成功合成了分枝桿菌細(xì)胞壁肽聚糖生物合成中的中間產(chǎn)物 UNAM。

使用 UNAM 和常規(guī)方法分別對(duì) DC-CIK 細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果表明 UNAM-DC-CIK 細(xì)胞的增殖能力高于常規(guī)方法培養(yǎng)的細(xì)胞。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，UNAM-DC-CIK 對(duì)荷瘤小鼠的治療效果比常規(guī)方法培養(yǎng)的 DC-CIK 更好，其帶瘤生存期更長(zhǎng)?？傊?，本研究為 DC-CIK 細(xì)胞的培養(yǎng)提供了新的方案，并為更多高活性細(xì)胞因子的篩選提供了有益參考。

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Biosynthesis and application of polypeptide UNAM in DC-CIK cell culture

SHI Bei-chen, FENG Qian, HAN Qiang, CHEN Hao-dong, SUN Yue, ZHOU Guo-dong, JIN Yuan-yuan, ZHANG Zhi-fei,

YANG Zhao-yong

Author Affiliations: School of Pharmacy, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China (SHI Bei-chen, HAN Qiang, CHEN Hao-dong, SUN Yue, ZHANG Zhi-fei); Department of Internal Medicine (FENG Qian), Department of Oncology (ZHOU Guo-dong), The Fourth People's Hospital of Zibo, Shandong 255067, China; Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (JIN Yuan-yuan, YANG Zhao-yong)

Study on the preparation of UDP-N-acetylmuramic acid (UNAM) and culture of DC-CIK cells using UNAM as an inducer, in order to enhance the activity and improve the recognition and killing effect of DC-CIK on tumor cells.Through the design ofenzymatic reaction route to synthesize peptide UNAM, theenzymatic reaction system was constructed, and the final product was purified and collected by preparative liquid chromatography. DC-CIK cells were induced by conventional culture method in the presence or absence of UNAM, and the therapeutic effect of the DC-CIK cells on tumor bearing mice was observed.Four enzymes, NahK、GlmU、MurA and MurB, involved in the biosynthetic pathway of UNAM were obtained byheterologous expression system. UNAM, an intermediate in the biosynthesis of peptidoglycan from mycobacterial cell wall, was successfully synthesized by the enzymatic reaction. In animal experiments, the therapeutic effect of UNAM-DC-CIK cells on tumor bearing mice was better than that of DC-CIK cells cultured by conventional methods, and the survival time is longer. The longest survival time in the UNAM-DC-CIK treatment group, DC-CIK treatment group and control group was 43 days, 38 days and 25 days, respectively.The proliferation and killing ability of UNAM-DC-CIK cells cultured with UNAM were higher than that of DC-CIK cells cultured by conventional methods.

polypeptide UNAM; biosynthesis; DC-CIK cells; anti-tumor

s: JIN Yuan-yuan, Email: jinyuanyuan@imb.pumc.edu.cn; ZHANG Zhi-fei, Email: zhangzhifeifei7208@ 163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.005

河北省自然科學(xué)基金（B2020209001）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81872782）；國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際（地區(qū)）合作與交流項(xiàng)目（81761128016）

金媛媛，Email：jinyuanyuan@imb.pumc.edu.cn；張志斐，Email：zhangzhifeifei7208@163.com

2021-02-20

*同為第一作者