姜羽，黃星宇，白利平

·論著·

靶向革蘭氏陰性菌生物膜的糖苷水解酶挖掘及功能研究

姜羽，黃星宇，白利平

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所衛(wèi)健委抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

挖掘?qū)Ω锾m氏陰性菌生物膜具有抑制和破壞作用，特別是具有跨種活性的糖苷水解酶。利用已有基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)序列相似性比對(duì)及基因注釋分析尋找新型糖苷水解酶，通過(guò)基因克隆和蛋白表達(dá)純化獲得一系列不同革蘭氏陰性菌來(lái)源的糖苷水解酶。以靶向銅綠假單胞菌生物膜的糖苷水解酶 PslG31-442作為陽(yáng)性對(duì)照酶，構(gòu)建靶向銅綠假單胞菌生物膜的藥物篩選模型，并進(jìn)一步構(gòu)建靶向肺炎克雷伯桿菌生物膜的藥物篩選模型。利用自行構(gòu)建的篩選模型對(duì)上述不同糖苷水解酶進(jìn)行活性篩選。篩選得到一種具有跨種活性的、來(lái)自克雷伯菌屬糖苷水解酶 19 家族的糖苷水解酶KPGH3。KPGH3 能夠有效抑制銅綠假單胞菌 PAO1、PA14 菌株以及肺炎克雷伯ATCC 700603 菌株生物膜的形成，EC50分別為36.85、43.34和 82.58 nmol/L；并能夠在 1 h 內(nèi)有效破壞 3 種菌株形成的成熟生物膜，EC50分別為45.35、29.3 和 18.23 nmol/L。糖苷水解酶 KPGH3 不但能在納摩爾級(jí)濃度抑制多種致病性革蘭氏陰性菌生物膜的形成，并能有效破壞上述菌株已經(jīng)形成的陳舊生物膜，具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

生物膜； 糖苷水解酶； 銅綠假單胞菌； 肺炎克雷伯桿菌； KPGH3

近年來(lái)，生物膜的形成已經(jīng)被認(rèn)定為大多數(shù)微生物引發(fā)感染和耐藥的關(guān)鍵因素。人體中約 80%的慢性和復(fù)發(fā)性微生物感染是由細(xì)菌生物膜引起的[1]。生物膜為包裹其中的病原菌提供了許多生存優(yōu)勢(shì)，包括但不限于：保護(hù)病原菌免受宿主免疫系統(tǒng)和抗菌藥物/抗生素的攻擊、保存水分、增加微生物對(duì)干燥的耐受性、吸收儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、保持高細(xì)胞外酶活性、對(duì)感染部位的黏附、細(xì)胞聚集、通過(guò)群體感應(yīng)協(xié)調(diào)毒力因子表達(dá)[2-4]。傳統(tǒng)治療細(xì)菌感染的方法直接靶向病原菌，但生物膜的存在使抗菌藥物的有效濃度提升到了危險(xiǎn)水平。此外，包裹在生物膜中的病原菌還可能產(chǎn)生代謝休眠細(xì)胞或分子持久性機(jī)制對(duì)抗藥物治療，這也是導(dǎo)致生物膜類感染在臨床治療停頓一段時(shí)間后復(fù)發(fā)的原因。在 2017 年 WHO 發(fā)布的急需研發(fā)新型抗生素的重點(diǎn)病原體清單中大部分為革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌由于含有不可滲透的細(xì)胞壁，與革蘭氏陽(yáng)性菌相比對(duì)抗體和抗生素具有更強(qiáng)的抵御力，具有很高的發(fā)病率和死亡率[5]。銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯桿菌是最常見的引發(fā)臨床感染的革蘭氏陰性致病菌，也是本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

細(xì)菌的生物膜由復(fù)雜的多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和胞外 DNA（eDNA）組成，可以將這些組分統(tǒng)稱為細(xì)胞外聚合物（EPS）[2]。細(xì)菌主動(dòng)分散生物膜的一個(gè)重要機(jī)制是產(chǎn)生細(xì)胞外酶，這些酶能夠作用于蛋白質(zhì)、eDNA 和胞外多糖這些 EPS 組成成分，促進(jìn)生物膜分散，使細(xì)菌變?yōu)楦哟嗳醯母∮螤顟B(tài)。借鑒生物膜的主動(dòng)分散機(jī)制，目前臨床已經(jīng)使用重組人 DNase I（rhDNase I）靶向 eDNA 進(jìn)而打散生物膜，輔助囊性纖維化患者肺部生物膜的抗生素治療[6]。此外，人工表達(dá)的表皮葡萄球菌分泌的絲氨酸蛋白酶 Esp 能夠通過(guò)降解細(xì)胞外聚合物中的蛋白質(zhì)抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，增強(qiáng)生物膜中金黃色葡萄球菌對(duì)人類 β-防御素 2（hBD2）的敏感性[7]。

在大多數(shù)生物膜中，EPS 的主要成分高度依賴于分泌的胞外多糖[2, 8-9]。胞外多糖對(duì)細(xì)菌生物膜的形成和維持具有許多重要功能，包括但不限于：結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、對(duì)抗抗菌藥物和宿主免疫系統(tǒng)的物理和化學(xué)防御、細(xì)胞間的黏附聚集、對(duì)干燥的耐受性、對(duì)有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物的吸收，在營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)提供碳源[2, 10-11]。目前已有研究證實(shí)靶向胞外多糖的糖苷水解酶具有抑制生物膜合成和破壞成熟生物膜結(jié)構(gòu)的能力，例如來(lái)源于銅綠假單胞菌胞外多糖合成路徑的糖苷水解酶 PelA47-303和 PslG31-442[12]，不但能夠有效抑制細(xì)菌生物膜的形成，還能夠破壞細(xì)菌已經(jīng)形成的成熟生物膜；進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示 PslG31-442與妥布霉素聯(lián)用能夠提高抗生素療效和銅綠假單胞菌感染傷口處細(xì)菌清除率[13]。鑒于目前發(fā)現(xiàn)的大部分化合物均不能夠破壞細(xì)菌成熟生物膜[12]，或需較長(zhǎng)孵育時(shí)間（≥ 24 h）才能夠破壞已形成的生物膜[14-16]，進(jìn)一步挖掘能夠在抑制生物膜形成的同時(shí)快速、有效破壞成熟生物膜，且具有雜泛性的糖苷水解酶對(duì)細(xì)菌生物膜防治至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 糖苷水解酶表達(dá)菌株BL21(DE3) 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)質(zhì)粒 pET 28a(+) 由本所赫衛(wèi)清研究員惠贈(zèng)；銅綠假單胞菌 PAO1 菌株、PA14 菌株由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所王曉雪研究員惠贈(zèng)；肺炎克雷伯桿菌（ATCC 700603）菌株由本所解云英研究員惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；BHI 培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；肺炎克雷伯菌株生物膜實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[17]中配方配置：以 M63 基本培養(yǎng)基輔以硫酸鎂、葡萄糖和酪蛋白氨基酸成分。上述培養(yǎng)基均以 121 ℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 重組糖苷水解酶的表達(dá)與純化 本實(shí)驗(yàn)中基因序列由北京華大基因合成并針對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，構(gòu)建在 pET 28a(+) 質(zhì)粒上。13 種蛋白 NCBI 序列號(hào)分別如下：ECGH1（WP_001546226.1），ECGH2（WP_000643258.1），ECGH3（WP_000620931.1），KPGH1（WP_ 040145971.1），KPGH2（WP_012068486.1），KPGH3（WP_012967893.1），KPGH4（WP_002911497.1），KPGH5（WP_002914970.1），KPGH6（WP_ 015958928.1），KPGH7（ABR78659.1），KPGH8（WP_009308665.1），KPGH9（WP_015959147.1），KPGH10（WP_004186817.1）。

將表達(dá)糖苷水解酶的工程菌株經(jīng) LB 固體平板活化，挑取單克隆至 3 ml LB 培養(yǎng)基中（含25 μg/ml Kan），37 ℃、220 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)。而后以 1:100 比例轉(zhuǎn)接至搖瓶，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至600為 0.5 ～ 0.6 時(shí)加入終濃度為 0.5 mmol/LIPTG，于18 ℃、220 r/min 過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。5000 ×、4 ℃離心 20 min 收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體，使用 binding buffer（20 mmol/L咪唑；50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5；300 mmol/L NaCl；2% V/V 甘油）重懸菌體后再次離心，洗凈 LB 培養(yǎng)基。使用添加蛋白酶抑制劑 PMSF（Ct= 1 mmol/L）、抑肽酶（Ct=2 μg/ml）、亮抑酶肽（Ct= 5 μg/ml）的 binding buffer 再次重懸菌液進(jìn)行超聲破碎，破碎 10 s、休息 10 s，共破碎 30 循環(huán)。破碎后菌液于 2000 ×、4 ℃離心收集上清液。上清經(jīng) 0.45 μm 濾膜過(guò)濾后與經(jīng) binding buffer 平衡后的 Ni 基質(zhì)在 4 ℃下結(jié)合 1 h，用 5 倍柱體積的 binding buffer 沖洗，最后用 elution buffer（250 mmol/L 咪唑；50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5；300 mmol/L NaCl；2% V/V 甘油）洗脫目的蛋白，經(jīng) SDS-PAGE 檢測(cè)后將目的蛋白用 30 K 超濾濃縮管置換 buffer 為 1 × PBS，備用。

1.2.2 生物膜抑制活性的測(cè)定 銅綠假單胞菌 PAO1 和 PA14 菌株經(jīng) LB 平板活化后用 LB培養(yǎng)基于 37 ℃、220 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)。而后利用BHI 培養(yǎng)基以 1:100 比例稀釋。將稀釋的菌液（95 μl/孔）添加到無(wú)菌 96 孔微量滴定板（NEST）中，并在每孔添加 5 μl 等分試樣的不同濃度糖苷水解酶，使之終體積為 100 μl。以 1 × PBS 代替糖苷水解酶作為陰性對(duì)照，以妥布霉素（Ct=0.1 mg/ml）作為陽(yáng)性對(duì)照。將 96 孔板放置于 25 ℃靜態(tài)孵育 12 h，以形成生物膜。為了消除邊緣效應(yīng)，在所有邊緣孔中添加 200 μl 無(wú)菌水，并用封口膜將平板密封。孵育后的 96 孔板用去離子水徹底洗滌，除去非黏附細(xì)胞和培養(yǎng)基，晾干。而后每孔加入 150 μl 0.1%（W/V）結(jié)晶紫染色 10 ～ 15 min，再次用水沖洗，晾干。最后每孔加入 150 μl 33%冰醋酸溶解剩余的染料并靜置 10 min，測(cè)定其在 595 nm 或 600 nm 下吸光度。生物膜數(shù)量與結(jié)晶紫染色吸光度成比例，所有反應(yīng)均重復(fù) 3 次。肺炎克雷伯菌株經(jīng) 37 ℃、220 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)后利用 1.1.2 中肺炎克雷伯桿菌生物膜實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，其余步驟與銅綠假單胞菌相同。

1.2.3 生物膜破壞活性的測(cè)定 對(duì)于生物膜破壞活性的測(cè)定，過(guò)夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯桿菌菌液以 1:100 比例稀釋后每孔 100 μl 菌液加入無(wú)菌 96 孔微量滴定板中靜態(tài)培養(yǎng) 12 h。孵育后用蒸餾水洗滌除去非黏附細(xì)胞和培養(yǎng)基，晾干。而后每孔加入 100 μl 用 1 × PBS 稀釋為不同濃度的糖苷水解酶，在 25 ℃下反應(yīng) 1 h。反應(yīng)后用蒸餾水洗滌平板淬滅反應(yīng)，平板晾干后每孔加入 150 μl 0.1%（W/V）結(jié)晶紫染色 10 ～ 15 min，再次洗滌、晾干并用 150 μl 33% 冰醋酸溶解定量，所有反應(yīng)均重復(fù) 3 次。培養(yǎng)生物膜之前在菌液中加入 5 μl 妥布霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 糖苷水解酶的表達(dá)與純化

利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的 13 種糖苷水解酶表達(dá)菌株 BL21(DE3)/pET-28a(+) 在 0.5 mmol/LIPTG、18 ℃條件下過(guò)夜誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，表達(dá)后菌體裂解液 SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖 1。而后將ECGH2、KPGH1-KPGH7 共 8 種成功在上清中表達(dá)的蛋白利用 Ni 柱純化，用 30 kD 超濾管將蛋白緩沖液置換為 1 × PBS，SDS-PAGE 分析結(jié)果見圖 2。

2.2 構(gòu)建銅綠假單胞菌以及肺炎克雷伯桿菌生物膜篩選模型

首先參照文獻(xiàn)[18]合成引物對(duì)基因（AAG05625.1）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，去除其跨膜片段并將之構(gòu)建在 pET 28a(+) 表達(dá)載體上，獲得涵蓋 31-442 位氨基酸殘基的表達(dá)質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)入BL21(DE3) 菌株中，誘導(dǎo)表達(dá) PslG31-442糖苷水解酶（圖 2）。因已有文獻(xiàn)證實(shí) PslG31-442對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1 菌株生物膜具有活性而對(duì) PA14 菌株生物膜無(wú)活性[12]，按照 1.2.2 中方法建立了銅綠假單胞菌生物膜抑制活性篩選模型并利用PslG31-442進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖 3A、B 所示，PslG31-442對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1 菌株生物膜有較強(qiáng)抑制活性而在相似濃度下對(duì) PA14 菌株生物膜無(wú)抑制活性，驗(yàn)證了篩選模型的成功建立。因銅綠假單胞菌為運(yùn)動(dòng)性細(xì)菌，所以染色后能夠在銅綠假單胞菌菌液的氣液交界面看到被結(jié)晶紫染為紫色的生物膜（圖 4A）。在此基礎(chǔ)上我們也成功建立了肺炎克雷伯桿菌的生物膜篩選模型，因肺炎克雷伯桿菌為非運(yùn)動(dòng)性細(xì)菌，所以能夠在平板孔底看到被染為紫色的生物膜（圖 4B）。

Figure 1 SDS-PAGE analysis of bacterial lysates from 13 different strains which contain plasmid encoding glycoside hydrolase

M：蛋白分子量標(biāo)記；1：PslG31-442；2：ECGH2；3 ～ 9：KPGH1-KPGH7

Figure 2 Purification of PslG31-442and 8 glycosidehydrolases

圖3 糖苷水解酶PslG31-442對(duì)銅綠假單胞菌菌株 PAO1（A）和 PA14（B）生物膜抑制活性（每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三個(gè)獨(dú)立結(jié)晶紫微量滴定孔實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值，生物膜數(shù)值依照未加PslG31-442蛋白的生物膜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理）

Figure 3 Inhibition ofPAO1 (A) andPA14 (B) biofilms formation by glycoside hydrolase PslG31-442(Each data point represents the mean from three independent experiments of crystal violet microtiter plate wells. The biomass values were normalized to that of pellicles without PslG31-442)

2.3 酶活性初篩

利用此前建立的篩選模型對(duì)純化獲得的 8 種可溶性糖苷水解酶的生物膜抑制活性進(jìn)行粗篩，結(jié)果如圖 5 所示。ECGH2 對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1 和肺炎克雷伯 ATCC 700603 菌株生物膜形成均有不同程度的抑制，但對(duì)銅綠假單胞菌 PA14 生物膜形成無(wú)抑制作用；而 KPGH1&2 僅對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1 生物膜形成有一定程度的抑制，對(duì)銅綠假單胞菌 PA14 和肺炎克雷伯 ATCC 700603 菌株生物膜形成無(wú)顯著抑制效果；BCA 蛋白定量結(jié)果顯示 8 種糖苷水解酶中 KPGH3 濃度最小，但在抑制生物膜形成的活性結(jié)果中可以看出 KPGH3 在 8 種糖苷水解酶中活性最強(qiáng)且具有跨種活性，對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1、PA14 以及肺炎克雷伯 ATCC 700603 菌株生物膜的形成均具有顯著抑制作用，因此我們選擇 KPGH3 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖4 銅綠假單胞菌（A）和肺炎克雷伯菌（B）的結(jié)晶紫染色結(jié)果（銅綠假單胞菌是運(yùn)動(dòng)性生物，在孔壁氣液界面處形成生物膜；肺炎克雷伯菌為非運(yùn)動(dòng)性生物，在孔底形成生物膜）

Figure 4 Crystal violet staining results of(A) and(B) (is motile organisms and form a biofilm at the air-liquid interface;is non-motile and forms a biofilm on the bottom of the well)

圖5 8 種糖苷水解酶對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1（A）、PA14（B）菌株以及肺炎克雷伯 ATCC 700603（C）菌株生物膜抑制活性粗篩結(jié)果（*P ≤0.05，**P ≤ 0.01）

Figure 5 The crude screening of 8 glycoside hydrolases for inhibition ofPAO1 (A),PA14 (B) and

ATCC 700603 (C) biofilm formations (*≤ 0.05,**≤ 0.01)

2.4 KPGH3 對(duì)不同革蘭氏陰性菌生物膜抑制活性的測(cè)定

在 25 ～ 0.2 nmol/L濃度范圍內(nèi)選擇 7 個(gè)濃度與菌液共孵育12 h，利用結(jié)晶紫染色測(cè)定其吸光度，以此表征 KPGH3 對(duì) 3 種菌株生物膜形成的抑制效果。從結(jié)果可以看出，KPGH3 在24.56 nmol/L 濃度下就顯示出了對(duì)銅綠假單胞菌PAO1 菌株生物膜形成的抑制作用，使用 GraphPad Prism7 計(jì)算其EC50為36.85 nmol/L；同濃度下 KPGH3對(duì)PA14 菌株生物膜的形成具有相似抑制效果，EC50為43.34 nmol/L；而與兩種銅綠假單胞菌株相比較，相同濃度的 KPGH3 對(duì)肺炎克雷伯 ATCC 700603 菌株生物膜形成的抑制作用較弱，經(jīng)計(jì)算其 EC50為82.58 nmol/L（圖 6）。

2.5 KPGH3 生物膜破壞活性的測(cè)定

進(jìn)一步檢測(cè) KPGH3 對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1 菌株、PA14 菌株以及肺炎克雷伯 ATCC 700603 菌株成熟生物膜的破壞作用。結(jié)果顯示，納摩爾濃度 KPGH3 能夠在1 h 內(nèi)快速、有效地破壞不同菌株生成的陳舊生物膜。可以看出，在24.56 nmol/L 作用濃度下，KPGH3 對(duì)肺炎克雷伯ATCC 700603 菌株形成的生物膜顯示出了最強(qiáng)的破壞活性。經(jīng)計(jì)算，KPGH3 對(duì) 3 種菌株生物膜破壞作用的EC50分別為45.35、29.3 和18.23 nmol/L（圖 7）。

3 討論

生物膜的頑固性是多種微生物共同創(chuàng)造的具有復(fù)雜物理、生物特性的結(jié)果，它往往涉及多種微生物相互作用，單一抗生素治療的效果差強(qiáng)人意。胞外多糖作為生物膜的重要組分能夠有效抑制抗生素的滲透[19-20]并為宿主免疫細(xì)胞吞噬提供屏障[21]，在細(xì)菌尤其是革蘭氏陰性菌的生物膜形成過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。由于胞外多糖對(duì)于生物膜結(jié)構(gòu)建立和維持的重要性，已經(jīng)有大量利用靶向胞外多糖的糖苷水解酶作為分散生物膜方法的研究，如 α-1,4-半乳糖苷酶 Ega3 能夠破壞由 GAG 依賴性煙曲霉和 Pel 多糖依賴性銅綠假單胞菌形成的生物膜[22]、PgaB 能夠破壞由表皮葡萄球菌形成的生物膜[23]等。以治療為目的開發(fā)的靶向胞外多糖的糖苷水解酶破壞生物膜所需的時(shí)間短、形成獲得性耐藥可能性低，并且由于靶向細(xì)胞外組分能夠躲避致病菌的多種細(xì)胞抗性機(jī)制，如外排泵、細(xì)胞內(nèi)藥物修飾等。

圖6 糖苷水解酶KPGH3 對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1（A）、PA14（B）菌株以及肺炎克雷伯 ATCC 700603（C）菌株生物膜形成的抑制活性（生物膜數(shù)值依照未加 KPGH3 蛋白的生物膜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理）

Figure 6 Inhibition effect of KPGH3 against the biofilms formation ofPAO1 (A),PA14 (B) and

ATCC 700603 (C) (The biomass values were normalized to that of pellicles without KPGH3)

圖7 糖苷水解酶KPGH3 對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1（A）、PA14（B）菌株以及肺炎克雷伯ATCC 700603（C）菌株生物膜破壞活性

Figure 7 The glycoside hydrolase KPGH3 destroyed mature biofilms ofPAO1 (A),PA14 (B) and

ATCC 700603 (C)

近期研究證明靶向銅綠假單胞菌 PAO1 菌株的糖苷水解酶 PslG31-442抑制生物膜形成，EC50可達(dá)到 4.1 nmol/L，1 h 作用時(shí)長(zhǎng)下破壞細(xì)菌生物膜 EC50可達(dá)到 12.9 nmol/L[12]。與此前研究發(fā)現(xiàn)的其他化合物相比，PslG31-442能夠快速、有效地破壞細(xì)菌形成的陳舊生物膜，酶活性極強(qiáng)。但 PslG31-442只靶向銅綠假單胞菌 PAO1 單一菌株的生物膜，面對(duì)臨床中大部分復(fù)雜、多物種生物膜共同感染，進(jìn)一步挖掘具有一定廣泛性、能夠同時(shí)靶向多種致病性微生物生物膜的糖苷水解酶便顯得尤為重要。在本研究中我們通過(guò)生物信息學(xué)方法尋找到了一種糖苷水解酶 KPGH3，純化后的高純度蛋白能夠在納摩爾濃度下抑制細(xì)菌生物膜的形成且在 1 h 內(nèi)快速、有效地破壞細(xì)菌成熟的生物膜；與 PslG31-442相比，雖然酶活性略有不及，但 KPGH3 能夠同時(shí)靶向銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯桿菌形成的生物膜，具有一定雜泛性，顯示出 KPGH3 極大的開發(fā)價(jià)值。根據(jù)文獻(xiàn)檢索的結(jié)果，該酶是首次在肺炎克雷伯桿菌中發(fā)現(xiàn)的、能夠靶向多種革蘭氏陰性菌生物膜的糖苷水解酶，相關(guān)生物學(xué)活性國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。

通過(guò) BLAST 分析我們得知 KPGH3 蛋白屬于糖苷水解酶 19 家族成員；隨后我們利用 InterPro 對(duì) KPGH3 整段序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其具有幾丁質(zhì)酶活性。幾丁質(zhì)為 N-乙酰葡糖胺通過(guò)β 糖苷鍵連接聚合而成，結(jié)構(gòu)同多糖，廣泛存在于甲殼類動(dòng)物的外殼、昆蟲的甲殼和真菌的胞壁中，也存在于一些綠藻中，但不存在于細(xì)菌中。幾丁質(zhì)的分解產(chǎn)物 N-乙酰葡糖胺是大部分革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性致病菌細(xì)胞壁和生物膜主要組分的前體，根據(jù) KPGH3 生信分析其可能具有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、幾丁二糖酶和β-N-乙酰葡萄糖苷酶等活性，我們推測(cè) KPGH3 體內(nèi)外功能如下：①KPGH3 通過(guò)靶向生物膜中多糖組分抑制生物膜的形成并破壞成熟生物膜；②在肺炎克雷伯桿菌體內(nèi)代謝中，KPGH3 可能通過(guò)水解環(huán)境中幾丁質(zhì)獲得 N-乙酰葡糖胺單體用于細(xì)胞壁的形成；③在菌株分解過(guò)程中，KPGH3 可能參與細(xì)胞壁中肽聚糖的降解，其降解產(chǎn)物可進(jìn)一步用于合成代謝或提供能量。綜上所述，我們認(rèn)為 KPGH3 是一種富有應(yīng)用前景的、能夠靶向革蘭氏陰性菌生物膜的糖苷水解酶，其酶學(xué)特征和多糖作用靶點(diǎn)將是該酶進(jìn)一步研究方向。

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Mining and functional study of glycoside hydrolases against biofilms of Gram-negative bacteria

JIANG Yu, HUANG Xing-yu, BAI Li-ping

Author Affiliation: NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To investigate glycoside hydrolases that can inhibit and disrupt Gram-negative bacteria biofilms, especially with cross-species activity.A series ofnovel glycoside hydrolase genes from different Gram-negative bacteria was mined through sequence similarity comparisons and gene annotation analysis based on existing genomic data. Encoded proteins was obtained through gene cloning, protein expression and purification. The glycoside hydrolase PslG31-442was expressed as a positive control to construct a screening model for the disruption ofbiofilms. Based on this, a drug screening model for disruption ofbiofilm was further constructed according to experimental requirements. Using a self-built screening model, the above-mentioned different glycoside hydrolases have been screened for activity.KPGH3, a member of glycoside hydrolases 19 family fromwith cross-kingdom activity, was obtained by screening. The study found that KPGH3 effectively inhibited the biofilm formation ofstrain PAO1, PA14 andATCC 700603, with an EC50of 36.85, 43.34 and 82.58 nmol/L, respectively. More importantly, KPGH3 were capable of disrupting preexisting biofilms in 1 h with an EC50of 45.35 (PAO1), 29.3 (PA14), and 18.23 nmol/L().The glycoside hydrolase KPGH3 not only significantly inhibits the formation of a variety of pathogenic Gram-negative bacteria biofilms, but also disrupts the preexisting biofilms that have been formed by the above-mentioned strains, which has a significant potential application value.

biofilm; glycoside hydrolase;;; KPGH3

BAI Li-ping, Email: lipingbai1973@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31870059）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2017-I2M-1-012）

白利平，Email：lipingbai1973@163.com

2020-12-24

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.001