韓珍珍，文玉輝

(運(yùn)城市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西 運(yùn)城 044000)

金黃色葡萄球菌隸屬葡萄球菌屬，是革蘭陽(yáng)性菌的代表，廣泛存在于動(dòng)物和人體內(nèi)，是人類化膿性感染最常見的病原菌，對(duì)各種理化因素都有較高的抵抗力[1]，是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一[2]。為提高藥品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)能力，2020年本實(shí)驗(yàn)室參加由中國(guó)食品藥品檢定研究院組織的藥品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)能力的驗(yàn)證，取得滿意結(jié)果。通過本次能力驗(yàn)證，再次確認(rèn)了實(shí)驗(yàn)室分析檢測(cè)技術(shù)，為其他實(shí)驗(yàn)室提供了參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

NIFDDC-PT-288金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證樣品3份，每份樣品采用棕色西林瓶包裝，鋁蓋密封，每瓶量按10 g計(jì)，編號(hào)為121(代號(hào)1)、176(代號(hào)2)、372(代號(hào)3)，由上海市食品藥品檢驗(yàn)所提供(中國(guó)食品藥品檢定研究院組織、上海市食品藥品檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)實(shí)施)。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 菌株及試劑

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保存中心，使用前經(jīng)全自動(dòng)生化檢定儀進(jìn)行生化確認(rèn)。甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥，批號(hào)：200828)，凍干兔血漿(陸橋，批號(hào)：200917)，革蘭氏染色液(陸橋，批號(hào)：200831)，陽(yáng)性菌鑒定卡(GP)(法國(guó)生物梅里埃公司)等。

1.2.2 儀器

濁度儀(法國(guó)生物梅里埃公司)、VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)、BHC-1300Ⅱ生物安全柜(蘇凈集團(tuán))、生化培養(yǎng)箱(上海博迅)、OLYMPUS顯微鏡等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書要求收到樣品應(yīng)盡快檢測(cè)，未檢測(cè)前放置在-20 ℃保存，并盡快檢測(cè)。檢測(cè)方法參照《中國(guó)藥典》2015版四部通則1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查和控制菌檢查方法。

1.3.1 菌種及培養(yǎng)基質(zhì)控

金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌使用前經(jīng)全自動(dòng)生化檢定儀進(jìn)行生化確認(rèn)。根據(jù)2015版藥典對(duì)甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查，此培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力+指示特性(實(shí)驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌)及抑制能力實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)菌株：大腸埃希菌)均符合要求。

1.3.2 前處理及劃線接種

在生物安全柜內(nèi)打開裝有樣品的西林瓶，向瓶?jī)?nèi)加入5 mL滅菌水，將樣品完全溶解并混勻后，轉(zhuǎn)移至90 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，再用滅菌水潤(rùn)洗西林瓶，總潤(rùn)洗體積為5 mL，將上述全部潤(rùn)洗液轉(zhuǎn)移至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。以此方法分別處理3份樣品，注意防止交叉污染(紫外燈殺菌30 min后操作下一個(gè)樣品)，同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照(加入金黃色葡萄球菌)和陰性對(duì)照(加入大腸埃希菌)，以上6瓶分別混勻后33 ℃培養(yǎng)18 h，將上述培養(yǎng)物分別劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3 菌種鑒定

分別挑取甘露醇氯化鈉瓊脂平板上的可疑菌落A和B(來源1)、C和D(來源2)、E(來源3)共五種，進(jìn)行觸酶實(shí)驗(yàn)、革蘭氏染色和血漿凝固酶試驗(yàn)，然后再進(jìn)行VITEK2 Compact生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

挑取甘露醇氯化鈉瓊脂平板上的疑似菌落，結(jié)合菌落形態(tài)特征(見圖1)、觸酶實(shí)驗(yàn)、革蘭染色(見圖2)、血漿凝固酶(見圖3和圖4)及VITEK2 compact生化鑒定結(jié)果，與陽(yáng)性對(duì)照菌進(jìn)行比對(duì)，確定1和3都未檢出金黃色葡萄球菌，2檢出金黃色葡萄球菌，詳見表1。甘露醇氯化鈉瓊脂平板主要原理是金黃色葡萄球菌能在高鹽平板上生長(zhǎng)，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，菌落發(fā)黃且光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊無皺褶，所以排除菌落B和菌落C。觸酶試驗(yàn)鑒定菌株是否產(chǎn)生過氧化氫酶。血漿凝固酶試驗(yàn)鑒定特點(diǎn)是血漿凝固，呈胨狀傾斜不流動(dòng)，據(jù)此排除A和E。

3 討 論

本次中檢院組織的藥品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證結(jié)果為滿意，我們主要做了以下準(zhǔn)備：第一，在能力驗(yàn)證前對(duì)購(gòu)買菌種及培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)控且設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，方便出現(xiàn)問題時(shí)查找原因[3]，再者進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)所涉及到的標(biāo)準(zhǔn)菌株、試劑及培養(yǎng)基、儀器設(shè)備進(jìn)行確認(rèn)，統(tǒng)籌安排好人員、試驗(yàn)方法及步驟，考慮試驗(yàn)進(jìn)行過程中可能出現(xiàn)的意外狀況并做好相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室預(yù)案，可以保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠。第二，實(shí)驗(yàn)操作過程對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果影響很大，操作過程的交叉污染和典型菌落的識(shí)別也易導(dǎo)致檢驗(yàn)人員對(duì)結(jié)果的判斷產(chǎn)生偏差[4]。本次能力驗(yàn)證樣品數(shù)量為3組，分組操作，每次操作間均紫外殺菌30 min以上，避免樣品的混淆和交叉污染，同時(shí)在使用標(biāo)準(zhǔn)菌株做質(zhì)控時(shí)，先操作陰性對(duì)照，再處理待測(cè)樣品，最后操作標(biāo)準(zhǔn)菌株。此外可疑菌落的確定是關(guān)鍵，要參照陽(yáng)性菌株培養(yǎng)基上的形態(tài)、顏色、質(zhì)地確定可疑菌落后再挑取。第三，血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用新鮮的培養(yǎng)物。放置時(shí)間過長(zhǎng)的培養(yǎng)物血漿凝固酶活性會(huì)降低，一些菌株可產(chǎn)生使血漿凝集物解集的葡激酶和纖溶酶，會(huì)使已經(jīng)凝固的血漿重新溶解，如不及時(shí)觀察會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果[5]。此次試驗(yàn)?zāi)X心浸出液肉湯(BHI)為新鮮配制，接菌培養(yǎng)時(shí)間為18 h，血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)每隔30 min觀察1次，血漿凝固酶陽(yáng)性菌株均在1 h后全部凝固，保證了時(shí)效。盛成蘭等[6]指出部分金黃色葡萄球菌凝固酶產(chǎn)生量低，短時(shí)間內(nèi)不易肉眼觀察，易造成實(shí)驗(yàn)失敗，故此試驗(yàn)在血漿凝固酶陽(yáng)性的基礎(chǔ)上又用全自動(dòng)生化儀對(duì)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)。第四，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，整理數(shù)據(jù)也是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，質(zhì)控人員要核對(duì)樣品編號(hào)，從小到大有序排列，避免樣品編號(hào)混淆。

圖1 甘露醇氯化鈉瓊脂平板(金黃色葡萄球菌)

圖2 放大1000×的金黃色葡萄球菌

圖3 血漿凝固酶試驗(yàn)

圖4 血漿凝固酶試驗(yàn)(凝固不流動(dòng))

表1 樣品在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征及生化鑒定結(jié)果表