李 剛，籍胤璽，侯曉東

(1.南陽市中心醫(yī)院骨科,河南 南陽 473000;2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,河南 開封 475000)

膝骨關(guān)節(jié)炎是因膝關(guān)節(jié)軟骨的退行性變致使軟骨及關(guān)節(jié)周圍肌肉損害進而引起的進展性關(guān)節(jié)疾病[1]。其發(fā)病機制為關(guān)節(jié)內(nèi)部的軟骨組織出現(xiàn)病變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨局部結(jié)構(gòu)性破壞及病變[2]。該病發(fā)生的生物力學(xué)因素是覆蓋在關(guān)節(jié)表面的關(guān)節(jié)軟骨退變，其病理過程分為軟骨組織內(nèi)出現(xiàn)蛋白降解、軟骨纖維化、滑膜炎3個階段[3]。膝骨關(guān)節(jié)炎的主要病理特點是滑膜增生[4]，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙、活動能力減低，伴有關(guān)節(jié)畸形等，嚴重影響患者日?；顒蛹吧尜|(zhì)量[5-6]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子主要由T 細胞等免疫細胞產(chǎn)生，參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展。TNF-α可影響軟骨細胞的代謝，有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)[7]。含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展密切相關(guān)，帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5,ADAMTS-5)可使軟骨中蛋白聚糖發(fā)生變性，從而出現(xiàn)降解[8]。鹽酸多奈哌齊可增加血管性癡呆大鼠腦組織中乙酰膽堿的水平，而乙酰膽堿具有抑制免疫細胞釋放大量炎癥因子的作用[9]?；诖?，本研究通過建立骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型來探討鹽酸多奈哌齊對骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中TNF-α和ADAMTS-5的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體級Sprague Dawley雌性大鼠30只，體質(zhì)量(200±17)g，購自上?；鶢栴D生物有限公司。

1.2 試劑與儀器鹽酸多奈哌齊購自衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司(國藥準字H20050978)，金屬基質(zhì)蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)抗體購自美國Abcam公司，TNF-α抗體購自上海滬崢生物公司，ADAMTS-5抗體購自上海士峰生物科技有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE) 染色試劑購自上海信帆生物科技有限公司，多聚甲醛購自濟南創(chuàng)世化工有限公司；伯樂電泳儀購自北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司，VT1200S振動切片機購自德國 Leica公司，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀購自美國Applied Biosystems公司，DYY-6C電泳儀購自北京六一儀器廠，BX41顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 模型制備與分組將大鼠隨機分為正常組、模型組和鹽酸多奈哌齊組，每組10只。模型組和鹽酸多奈哌齊組大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射40 g·L-1木瓜蛋白酶 0.15 mL制備膝骨關(guān)節(jié)炎模型，3 d注射1次，共注射3次；正常組大鼠注射等體積的生理鹽水。造模后進行組織病理學(xué)檢查，脛骨遠端骨小梁吸收破壞，累及骨皮質(zhì)，關(guān)節(jié)軟骨可見壞死性脫落、纖維化、關(guān)節(jié)腔狹窄為造模成功。造模成功后第7天，鹽酸多奈哌齊組大鼠給予鹽酸多奈哌齊(3 mL·kg-1)灌胃，每日1次；正常組和模型組大鼠給予相同劑量的生理鹽水灌胃；均持續(xù)灌胃6周。

1.4 大鼠關(guān)節(jié)炎癥程度評估3組大鼠分別于灌胃1、3、6周時采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分評估大鼠關(guān)節(jié)炎癥程度。0分：關(guān)節(jié)無明顯炎癥；1分：小趾關(guān)節(jié)有輕微炎癥；2分：趾關(guān)節(jié)和足趾關(guān)節(jié)有明顯炎癥；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪關(guān)節(jié)有明顯炎癥；4分：踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪關(guān)節(jié)有明顯炎癥。

1.5 HE染色觀察大鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變情況灌胃結(jié)束時麻醉處死大鼠，取膝關(guān)節(jié)，甲醛溶液固定膝關(guān)節(jié)組織，乙醇脫水，石蠟包埋后切片(厚4 μm)，山羊血清封閉，蘇木精染色6～8 s，伊紅染色液復(fù)染10 s。于顯微鏡下觀察大鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變情況。

1.6 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase- polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測大鼠軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA表達取各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織，加入1.25 g·L-1胰蛋白酶消化 4 h,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗,滴入9 g·L-1氯化鈉溶液，TRIzol法提取總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。TNF-α上游引物序列為5′-CTGGGCAGCGTTTATTCT-3′，下游引物序列為5′-TTGCTTCTTCCCTGTTCC-3′；ADAMTS-5上游引物序列為5′-CTTGACCTTCGGCCTGA-3，下游引物序列為5′-CACTGTTTGTGGGTGCAG-3′；內(nèi)參β-action上游引物序列為5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物序列為5′-GACGTAGCACAGCTTCTCCTTAATG-3′。應(yīng)用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對TNF-α、ADAMTS-5 mRNA表達水平進行檢測。反應(yīng)條件：98 ℃ 6 min，98 ℃ 28 s，75 ℃ 30 s，80 ℃ 4 min，共55個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，取均值。采用2-ΔΔCt法計算TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相對表達量。

1.7 Western blot法檢測大鼠軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5蛋白表達將軟骨組織置于裝有細胞裂解液玻璃勻漿器中裂解30 min，超聲破碎 (10 s，3次) 后4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，取上清液用生物活性炭法檢測蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(每孔加樣20 μg蛋白)，轉(zhuǎn)膜,加入50 g·L-1脫脂奶粉，然后加入0.01 mol·L-1PBS沖洗，室溫封閉1 h 后，TBST 洗膜，加入ADAMTS-5、TNF-α一抗(11 000)，4 ℃過夜;TBST洗膜，分別加入對應(yīng)二抗(11 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，增強化學(xué)發(fā)光法顯色。應(yīng)用Image J軟件分析ADAMTS-5、TNF-α及磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehgde phosphate dehydrogenase,GAPDH)灰度值。以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。實驗重復(fù)10次，取均值。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 陽性表達大鼠軟骨組織于體積分數(shù)10%中性甲醛緩沖液中固定24 h后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，完成蠟塊制備。組織蠟塊經(jīng)修片、切片、展片、烤片，完成石蠟切片制作。石蠟切片進行免疫組織化學(xué)染色，滴加一抗，37 ℃靜置2 h或4 ℃過夜；一抗稀釋比例TNF-a(150)，ADAMTS-5(1100)，滴加二抗辣根過氧化物酶標記的抗鼠/兔的二抗和3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色液，PBS洗3次,每次2 min；室溫下顯色10 min，顯微鏡下觀察染色程度，自來水沖洗10 min，脫水、透明、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察TNF-α和ADAMTS-5陽性表達結(jié)果，并計算TNF-α陽性細胞數(shù)與ADAMTS-5陽性細胞數(shù)。細胞質(zhì)被染成棕褐色為陽性細胞。每張切片隨機選取5個視野，200倍光學(xué)顯微鏡下進行陽性細胞計數(shù)，取平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較結(jié)果見表1，灌胃1、3、6周時，模型組和鹽酸多奈哌齊組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分均顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較

2.2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變情況結(jié)果見圖1。正常組大鼠未見滑膜組織炎癥細胞浸潤，未發(fā)現(xiàn)滑膜纖維增生現(xiàn)象；模型組大鼠關(guān)節(jié)組織內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，關(guān)節(jié)囊可見囊性炎癥增生，囊內(nèi)韌帶神經(jīng)損傷，滑膜和纖維組織增生；鹽酸多奈哌齊組大鼠滑膜組織炎癥細胞浸潤減少，纖維增生改善。

A：正常組；B：模型組；C：鹽酸多奈哌齊組。

2.3 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相對表達量比較結(jié)果見表2。模型組和鹽酸多奈哌齊組膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相對表達量顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相對表達量均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相對表達量比較

2.4 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5蛋白相對表達量比較結(jié)果見圖2和表3。模型組和鹽酸多奈哌齊組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 蛋白相對表達量均顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 蛋白相對表達量均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 蛋白表達

表3 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5 蛋白相對表達量比較

2.5 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5陽性細胞數(shù)比較結(jié)果見圖3和表4。模型組和鹽酸多奈哌齊組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5陽性細胞數(shù)均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5陽性細胞數(shù)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5表達(免疫組織化學(xué)染色，×200)

表4 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5陽性細胞數(shù)比較

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種關(guān)節(jié)退行性病變，多數(shù)患者青年時期就患有該病，但常無明顯癥狀，隨著年齡的增長,膝關(guān)節(jié)軟骨的退變進行性加重，進而出現(xiàn)臨床癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[9-11]。大鼠膝骨關(guān)節(jié)受到損傷時軟骨周圍血管內(nèi)的血液循環(huán)出現(xiàn)阻礙，膝骨關(guān)節(jié)液的吸收和釋放能力紊亂，軟骨組織內(nèi)營養(yǎng)供給不足，有害物質(zhì)聚集無法排出，導(dǎo)致軟骨細胞損傷及基質(zhì)異常[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)被大量炎癥細胞浸潤，關(guān)節(jié)囊可見囊性炎癥增生，滑膜和纖維組織增生，鹽酸多奈哌齊組大鼠滑膜組織的病理改變較模型組輕，正常組大鼠未見滑膜組織炎癥細胞浸潤、未發(fā)現(xiàn)滑膜纖維增生現(xiàn)象；證實鹽酸多奈哌齊能夠顯著改善膝關(guān)節(jié)炎癥浸潤和纖維增生。有研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸多奈哌齊可對炎癥細胞產(chǎn)生調(diào)控作用，提高機體免疫力，改善關(guān)節(jié)炎癥[13-14]。相關(guān)研究表明，鹽酸多奈哌齊治療大鼠骨關(guān)節(jié)炎療效較好，其作用機制可能與抑制炎癥反應(yīng)和軟骨細胞凋亡有關(guān)[15]。劉艷偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α表達水平高于正常組大鼠，提示TNF-α在軟骨退變和骨關(guān)節(jié)炎癥中起重要作用，可促進骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組和鹽酸多奈哌齊組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5蛋白相對表達量均高于正常組，鹽酸多奈哌齊組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5蛋白相對表達量低于模型組。與正常組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5陽性細胞數(shù)均高于正常組，鹽酸多奈哌齊組大鼠膝關(guān)節(jié)軟組織中TNF-α、ADAMTS-5陽性細胞數(shù)低于模型組。有文獻報道，ADAMTS-5參與調(diào)控多種組織、細胞、器官的生長發(fā)育，在軟骨增生過程中發(fā)揮重要作用，ADAMTS-5可破壞關(guān)節(jié)血管的生成，在膝骨關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[16]。TNF-α是骨關(guān)節(jié)炎的重要炎癥物質(zhì)，誘導(dǎo)軟骨細胞出現(xiàn)氧化反應(yīng)，可與ADAMTS-5共同作用促進骨細胞的吸收[17]。TNF-α參與機體內(nèi)多種細胞的增殖、凋亡過程，在正常生物體內(nèi)TNF-α呈低表達，在患病生物體內(nèi)TNF-α呈高表達[18]。本研究中，給予鹽酸多奈哌齊干預(yù)后，大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5表達水平隨之下降，提示鹽酸多奈哌齊可能通過降低大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、ADAMTS-5表達而改善病情,與張大偉[19]研究結(jié)果一致。

綜上所述，鹽酸多奈哌齊可通過抑制膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、ADAMTS-5表達對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨起到保護作用。