杭小英 袁雪梅 呂孫建 張海琪 劉莉 于喆 施偉達(dá)

摘要：采用MTT法，選擇黃芪多糖、白花蛇舌草、金銀花、葡萄糖酸鋅、板藍(lán)根、白芍、連翹及黃藤素8種中草藥對大口黑鱸彈狀病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV）進(jìn)行體外抗病毒試驗，并挑選黃芪多糖，利用熒光定量PCR方法研究其對病毒復(fù)制和宿主細(xì)胞內(nèi)凝集素基因（Intelectin）表達(dá)的影響。體外抗病毒試驗結(jié)果顯示，黃芪多糖抗MSRV效果最好，兼具顯著的阻斷、抑制和中和病毒的效果，其最高阻斷作用率為59.13%，最高抑制率為21.64%，最高中和率為105.46%。同時，黃芪多糖還可以抑制MSRV的復(fù)制，上調(diào)細(xì)胞Intelectin基因的表達(dá)。另外，連翹、金銀花和白芍對MSRV分別有顯著的阻斷作用（阻斷作用率為16.92%）、抑制作用（抑制率為21.64%）、中和作用（中和率為54.01%）。結(jié)果表明，黃芪多糖相較試驗中其他中草藥制劑具有更好的抗MSRV效果，可為MSRV的藥物防控提供參考。

關(guān)鍵詞：大口黑鱸;彈狀病毒;中草藥;黃芪多糖;MTT法;抗病毒試驗;Intelectin基因

中圖分類號： S941.41+9 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0155-05

大口黑鱸（Micropterus salmoides），別稱加州鱸、黑鱸，是太陽魚科黑鱸屬魚類，主要棲息在溫暖區(qū)域的湖泊與池塘[1]。大口黑鱸人工繁殖于1983年成功，因其味道鮮美、無肌間刺，富含蛋白質(zhì)，深受消費者的喜愛，現(xiàn)已推廣到浙江省、江蘇省和廣東省等20多個?。ㄊ校?。據(jù)《2019中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》報告，大口黑鱸2018年全國的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)約43.2萬t，成為我國優(yōu)質(zhì)的特種淡水養(yǎng)殖品種[2]。

近幾年，隨著大口黑鱸養(yǎng)殖行情的上升，養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大，暴發(fā)性疾病也在不斷發(fā)生，其中有一種疾病常在鱸魚幼苗階段暴發(fā)，傳染性強(qiáng)，且死亡率極高。苗種和養(yǎng)殖企業(yè)常用抗菌藥物進(jìn)行治療，但沒有效果[3]。學(xué)者們通過對發(fā)病池塘的病魚進(jìn)行采樣分析，確認(rèn)引起大口黑鱸魚苗出現(xiàn)大規(guī)模死亡的疾病為彈狀病毒病。該病病原為RNA病毒，名為大口黑鱸彈狀病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，簡稱MSRV），病毒粒子大小約為53 nm×140 nm，形似子彈，故名彈狀病毒[1]。該病不僅可以通過養(yǎng)殖水體進(jìn)行水平傳播，也可以通過親魚繁殖進(jìn)行縱向傳播，極容易傳染，且往往出現(xiàn)病魚后一周內(nèi)全部死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

中草藥（Chinese herb medicine）因富含苷、有機(jī)酸、多糖、生物堿、鞣質(zhì)和黃酮類等有效成分[6]，成為我國傳染水產(chǎn)病害防治的主要手段之一。相較于西藥，中草藥作為藥劑具有副作用小，對養(yǎng)殖環(huán)境影響小，不激發(fā)藥源性疾病等優(yōu)勢，且能通過不同作用機(jī)制對病毒產(chǎn)生抑制作用，如阻斷病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合，抑制病毒核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白合成，抑制病毒釋放等[7]。Wang等發(fā)現(xiàn)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯能阻斷草魚呼腸孤病毒與細(xì)胞表面的受體蛋白結(jié)合，從而達(dá)到抑制病毒的感染目的[8]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯也能抑制白斑綜合征病毒的感染[9]。此外，研究表明中草藥制劑還可以提高機(jī)體的非特異性免疫水平，甚至誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，從而達(dá)到抵抗病毒感染的目的。Haetrakul等發(fā)現(xiàn)，注射扭序花葉片提取物可以提高鯉魚對CyHV-3的抗性[10]。Balasubramanian等發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對蝦食用含有印度木橘、苦瓜和狗牙根提取物的飼料后，其對白斑綜合征病毒的抗性作用得到了顯著提高，其中食用含 100 mg/kg的狗牙根水提取物的飼料可以使斑節(jié)對蝦攻毒存活率達(dá)100%[11]。

本研究在結(jié)合傳統(tǒng)中草藥理論及相關(guān)抗病毒藥物研究的基礎(chǔ)上，篩選出黃芪多糖、連翹、板藍(lán)根等8種中草藥，測定以上中草藥對MSRV的體外抑制作用，從中篩選出有效的抗MSRV中草藥，旨在為大口黑鱸彈狀病毒病防治提供可行且符合市場要求的治療方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用大口黑鱸魚苗購自浙江省湖州市某養(yǎng)殖場，MSRV毒株及草魚卵巢細(xì)胞（CO）均由筆者所在單位魚病研究室分離培養(yǎng)保存，黃芪多糖、連翹等中草藥購自陜西森弗高科實業(yè)有限公司。M199培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞生長液、雙抗（青霉素 100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL）、胰蛋白酶均購自Gibco公司;MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;TRIzol總RNA 提取試劑、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR熒光定量檢測試劑購自 TOYOBO公司。

1.2 試驗方法

本研究于2019年1月開始，相關(guān)試驗均在浙江省淡水水產(chǎn)研究所重點實驗室完成。

1.2.1 病毒滴度的測定 病毒滴度檢測按照實驗室常規(guī)方法[12]進(jìn)行，CO細(xì)胞用胰酶消化后，按照 1×105/孔的密度加到96孔板，25 ℃培養(yǎng)12 h，待測病毒經(jīng)10倍梯度稀釋后，加入96孔板中，每孔添加量為100 μL細(xì)胞懸液，每個稀釋度做8孔重復(fù)，同時設(shè)正常細(xì)胞為陰性對照，連續(xù)觀察5 d。根據(jù)病變情況，按 Karber 氏法計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）[13]。

1.2.2 黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對CO細(xì)胞安全濃度的測定 將8種中草藥分別溶解于雙蒸水，經(jīng)0.22 μm濾膜除菌后保存于4 ℃?zhèn)溆?。采用CPE法測定黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅、板藍(lán)根、連翹、白芍、黃藤素及白花蛇舌草等8種中草藥對CO細(xì)胞的最大安全濃度。將藥物倍比稀釋后接種于96孔板中的CO細(xì)胞，每個稀釋度做4個重復(fù)，另設(shè)1組正常細(xì)胞對照，25 ℃培養(yǎng)96 h，取不引起細(xì)胞病變的最大濃度為該藥物的安全濃度。

1.2.3 黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對MSRV的阻斷作用測定 在安全濃度基礎(chǔ)上將8種中草藥分別倍比稀釋成4個稀釋度，加到長成單層CO細(xì)胞的96孔板中，按每孔100 μL添加各濃度藥物，每個稀釋度做4孔重復(fù)孔。在25 ℃孵育4 h后吸走各孔藥物，另加入100 μL 100 TCID50的病毒液，于25 ℃吸附1.5 h，隨后吸去病毒液，加入細(xì)胞維持液，另設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照。25 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察CPE，當(dāng)病毒對照CPE達(dá)到“+ + +”“+ + + +”時，記錄CPE情況，并測定96孔板中細(xì)胞的活性，計算藥物的作用率。

1.2.4 黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對MSRV的抑制作用測定 待96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的CO細(xì)胞長成單層后，按每孔100 μL的添加量接種100 TCID50的病毒液，于25 ℃吸附1.5 h，棄去病毒液，加入安全濃度范圍內(nèi)倍比稀釋的中藥提取物，每孔100 μL，每個稀釋度做4孔重復(fù)，另設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照。25 ℃培養(yǎng)，記錄方法同“1.2.3”節(jié)，并用MTT法檢測細(xì)胞存活量，并計算抑制率，方法和公式同“1.2.3”節(jié)。

1.2.5 黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對MSRV的中和作用測定 將8種中草藥安全濃度范圍內(nèi)4個稀釋度的藥液分別與等體積 100 TCID50 病毒液混合，25 ℃作用2 h，加到長成單層CO的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔100 μL，每個稀釋度做4孔重復(fù)，另設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照。25 ℃ 中培養(yǎng)，記錄方法同“1.2.3”節(jié)，用MTT法檢測細(xì)胞存活量，計算中和作用率，方法和公式同“1.2.3”節(jié)。

1.2.6 黃芪多糖對病毒復(fù)制的影響 分別按照“1.2.3”“1.2.4”“1.2.5”節(jié)中的方法進(jìn)行處理，分為阻斷試驗組、抑制試驗組和中和試驗組，同時設(shè)計等劑量病毒感染CO細(xì)胞的病毒對照組和正常細(xì)胞對照組。于病毒接種后6、12、24、48、72 h收集細(xì)胞病毒液，TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄參照TOYOBO公司的“ReverTra Ace qPCR RT Master Mix”試劑盒合成cDNA。應(yīng)用引物MSRV-F/MSRV-R對樣品cDNA進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序參考之前的研究方法[4]。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到樣品中病毒基因組的拷貝數(shù)。

1.2.7 黃芪多糖對CO細(xì)胞Intelectin表達(dá)的影響 按照“1.2.6”節(jié)所述步驟處理樣品，分別用引物Intelectin-F/Intelectin-R及β-actin-F/β-actin-R對樣品cDNA進(jìn)行Real-time PCR，反應(yīng)體系及程序參考之前的研究方法[4]。通過軟件利用2-ΔΔCT方法計算各組Intelectin表達(dá)量相對于對照組的倍數(shù)關(guān)系。各試驗組和細(xì)胞對照組之間Intelectin基因的表達(dá)差異分析方法參照“1.2.6”節(jié)進(jìn)行。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 各試驗組與病毒對照組之間的差異用SPSS 16.0中的單因素方差分析法（One-way ANOVA）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSRV TCID50

通過試驗測得MSRV 滴度為108 TCID50/mL。

2.2 8種中草藥對CO細(xì)胞的安全濃度

采用CPE方法，測得黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅、板藍(lán)根、白芍、白花蛇舌草、連翹及黃藤素8種中草藥對CO細(xì)胞的安全濃度分別為12.500、0.049、0.003、1.560、0.049、3.130、0.012、3.125 mg/mL。

2.3 8種中草藥對MSRV的阻斷作用效果

8種中草藥對MSRV的阻斷作用檢測結(jié)果見表1，對病毒阻斷效果最好的中草藥為黃芪多糖，其最高阻斷作用率為59.13%，其次為連翹，最高阻斷作用率為16.92%，其他中草藥未表現(xiàn)出明顯的病毒阻斷作用。

2.4 8種中草藥對MSRV的抑制作用效果

試驗測得黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對MSRV的抑制作用率結(jié)果見表2，對病毒抑制效果最好的中草藥為黃芪多糖，其最高抑制率為63.68%，其次為金銀花，最高抑制率為21.64%，其他中草藥未表現(xiàn)出明顯的病毒抑制作用。

2.5 8種中草藥對MSRV的中和作用效果

試驗測得黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅等8種中草藥對MSRV的中和作用率結(jié)果見表3，結(jié)果顯示黃芪多糖、白芍及白花蛇舌草對病毒均有一定的中和作用，其中中和作用最好的是黃芪多糖，最高中和率可達(dá)105.46%，其次是白芍，最高中和率為54.01%，其他中草藥未表現(xiàn)出明顯的病毒中和作用。

2.6 黃芪多糖對MSRV復(fù)制的影響

試驗結(jié)果見圖1，自24 h起，各試驗組病毒的拷貝數(shù)均低于病毒對照組，但差異不顯著（P>0.05）。

2.7 黃芪多糖對CO細(xì)胞Intelectin基因表達(dá)的影響

從圖2可以看出，各試驗組Intelectin基因的表達(dá)量均出現(xiàn)一個先升高再降低的趨勢，其中24 h時

各試驗組細(xì)胞Intelectin基因表達(dá)量均極顯著高于細(xì)胞對照組（P<0.01），中和試驗組在48、72 h時Intelectin的表達(dá)量仍極顯著高于細(xì)胞對照組（P<0.01）。

3 討論與結(jié)論

大口黑鱸彈狀病毒病于2015年在浙江地區(qū)發(fā)現(xiàn)，主要感染對象為大口黑鱸，在親魚及幼苗中均能檢測到該病毒，且主要在幼苗階段發(fā)病，具有極高的死亡率[1]。中草藥提取物具有天然結(jié)構(gòu)，生物活性較為完整，已被證實不僅能夠促進(jìn)動物生長、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝和免疫力，還能提高機(jī)體的抗感染能力[6，14]。本研究選取黃芪多糖、金銀花、葡萄糖酸鋅、板藍(lán)根、白芍、白花蛇舌草、連翹及黃藤素8種中草藥進(jìn)行體外抑制病毒測試，結(jié)果顯示黃芪多糖對MSRV具有較高的阻斷、抑制和中和效果。另外，連翹對MSRV也有一定的阻斷效果，金銀花對該病毒有一定的抑制和中和效果，但均不如黃芪多糖明顯。本研究驗證了以上4種中草藥的抗病毒效果，但黃芪多糖、連翹、金銀花和白芍對MSRV的抑制機(jī)制不同，這與已有的研究結(jié)果一致。

連翹為木樨科植物，其主要成分連翹酯苷藥理作用廣泛，其中抗病毒療效尤為顯著，對多種病毒均有一定的抑制效果，包括呼吸道合胞病毒[15]、腺病毒[16]、流感病毒[17]和皰疹病毒[18]等。田文靜等發(fā)現(xiàn)，連翹水提液能夠明顯抑制呼吸道合胞病毒[15]。王岌等用MTT法也觀察到連翹在HEPG2細(xì)胞中也能抑制呼吸道合胞病毒的復(fù)制[19]。本研究顯示，連翹對MSRV主要表現(xiàn)為阻斷效果，推測其可能抑制了病毒衣殼蛋白與細(xì)胞受體蛋白結(jié)合的過程。劉穎娟等也發(fā)現(xiàn)，連翹有效成分在細(xì)胞上對單純皰疹病毒的復(fù)制能起到阻斷和抑制的作用[18]。金銀花對MSRV主要表現(xiàn)為抑制作用，可能參與了細(xì)胞對MSRV病毒的復(fù)制及病毒顆粒裝備過程的抑制作用。金銀花曾被證明能夠抑制合胞體病毒，金銀花中綠原酸可以下調(diào)細(xì)胞TLR3、TBK1和p-IRF3蛋白，從而起到良好的抗病毒作用[20]。張旋等也證實，金銀花對呼吸道合胞病毒的生物合成具有抑制作用[21]。另外，白芍也對MSRV具有一定的抗病毒作用，主要表現(xiàn)為體外能夠中和病毒，肖尚喜等發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可以提高IFN效價，具有抗病毒作用，能使水泡性口炎病毒效價顯著下降[22]。

以上3種中草藥提取物均表現(xiàn)出一定的抗MSRV活性，但均不如黃芪多糖對MSRV的作用效果明顯，黃芪多糖對MSRV的最高阻斷作用率為59.13%，最高抑制率為63.68%，最高中和率為105.46%，均明顯高于其他中草藥提取物。另外，熒光定量結(jié)果顯示，黃芪多糖在作用24 h后也表現(xiàn)出對MSRV的復(fù)制有一定的抑制作用，雖然差異不顯著。黃芪多糖具有較寬的抗病毒譜，對流感病毒、柯薩奇病毒、皰疹病毒和乙型肝炎病毒等病毒有明顯的抗性[23]。李麗婭等發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能抑制通過滴鼻感染上流感病毒的小鼠出現(xiàn)明顯的肺炎和病毒增殖[24];黃芪總皂苷、總多糖和總黃酮則在體外試驗中表現(xiàn)出對HSV-2333株皰疹病毒的多種抗病毒效應(yīng)，包括殺滅、阻斷，甚至是直接抑制病毒增殖[25];楊潔等研究表明，黃芪多糖能夠抗多株柯薩奇病毒（CVB-A16、CVB-B1、CVB-B3和CVB-B4），其水提液可抑制該病毒敏感細(xì)胞系中的病毒增殖[26]。鄒宇宏等研究發(fā)現(xiàn)，黃芪總苷在抑制乙肝病毒HBV-DNA轉(zhuǎn)染HepG2-2.2.15細(xì)胞表面分泌HBsAg和HBeAg的同時，還能抑制細(xì)胞增殖[27]。以上研究均說明黃芪多糖兼具阻斷感染、抑制病毒增殖和中和病毒的作用，本研究結(jié)果與之一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖還可以顯著提高CO細(xì)胞Intelectin基因的表達(dá)水平，而該基因主要參與細(xì)胞對病原微生物的識別、啟動機(jī)體的免疫防御等過程。Podok 等發(fā)現(xiàn)，用CyHV-2感染異育銀鯽后，魚體的Intelectin基因表達(dá)量顯著上調(diào)，推測其可能參與了病毒的識別過程[28];Gu等也發(fā)現(xiàn)，該基因參與了病毒性腦炎誘導(dǎo)的機(jī)體免疫反應(yīng)[29]。

本研究首次篩選了抗MSRV的中草藥，黃芪多糖、連翹、金銀花和白芍均對MSRV表現(xiàn)出不同機(jī)制的抗病毒作用，其中黃芪多糖的作用效果最為顯著。該研究結(jié)果可為后續(xù)抗大口黑鱸彈狀病毒及其他病毒藥物的篩選提供理論依據(jù)。

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