章麗嬌 李銀 劉青濤 劉宇卓 韓凱凱 趙冬敏 黃欣梅 楊婧

摘要：坦布蘇病毒是我國新發(fā)易引起家禽出現(xiàn)嚴(yán)重產(chǎn)蛋下降和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的重要傳染病病原。通過特異性的化學(xué)阻斷劑預(yù)處理DF-1細(xì)胞，噬斑計(jì)數(shù)法檢測其對病毒滴度的影響，相對熒光定量RT-PCR檢測其對病毒核酸表達(dá)的影響，并對影響顯著的結(jié)果進(jìn)行吸附和內(nèi)吞試驗(yàn)。結(jié)果顯示，網(wǎng)格蛋白抑制劑氯丙嗪和動力蛋白抑制劑dynasore可顯著降低病毒滴度和病毒核酸表達(dá)，且主要作用于內(nèi)吞過程，對病毒吸附無影響。膽固醇抽提劑甲基-β-環(huán)糊精、小窩蛋白抑制劑genistein及胞吞抑制劑EIPA對病毒滴度無明顯影響。結(jié)果表明，坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞依賴于網(wǎng)格蛋白和動力蛋白，而不依賴于膽固醇、小窩蛋白和胞吞作用。

關(guān)鍵詞：坦布蘇病毒;DF-1細(xì)胞;入侵

中圖分類號：S852.65+7?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）15-0155-04

收稿日期：2021-03-14

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20180303）;國家自然科學(xué)基金（編號：31802200）。

作者簡介：章麗嬌（1987—），女，浙江德清人，博士，助理研究員，主要從事家禽病毒分子生物學(xué)研究。E-mail：zhang62810003@126.com。

坦布蘇病毒隸屬黃病毒科黃病毒屬，于2010年4月首先在我國東南沿海地區(qū)養(yǎng)鴨場暴發(fā)并迅速蔓延至我國大部分主要水禽養(yǎng)殖地區(qū)[1-2]?；疾∪怿喼饕憩F(xiàn)為采食下降和生長緩慢，患病蛋鴨主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降，嚴(yán)重者均可出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、癱瘓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率為5%～30%[3]。迄今為止，病毒感染宿主范圍十分廣泛，不僅包括不同品種的家養(yǎng)鴨，還蔓延至鵝、雞、肉鴿甚至麻雀等其他禽類[4-7]。我國是水禽生產(chǎn)大國，坦布蘇病毒的暴發(fā)和流行對水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

病毒感染宿主細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中入侵是病毒對靶細(xì)胞建立有效感染的第一步，包括病毒與細(xì)胞受體結(jié)合、內(nèi)吞與脫殼。研究報(bào)道，病毒可通過多種內(nèi)吞方式進(jìn)入宿主細(xì)胞，主要包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑、巨胞飲作用及其他尚未明確的內(nèi)吞機(jī)制等[8]。同時(shí)，各種宿主細(xì)胞元件諸如膽固醇、動力蛋白、Rab5等能夠被病毒利用參與內(nèi)吞過程。不同病毒入侵不同宿主細(xì)胞的方式是多樣化的。比如，乙型腦炎病毒通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵C6/36和 HeLa 細(xì)胞[9-10]，通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵神經(jīng)細(xì)胞[11];而西尼羅病毒則依賴脂笩入侵神經(jīng)細(xì)胞和HeLa細(xì)胞[12]。

坦布蘇病毒感染宿主廣，有組織泛嗜性，體外感染鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）、雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）及C6/36蚊子細(xì)胞等多種細(xì)胞系。入侵作為病毒感染的首要環(huán)節(jié)，與病毒泛嗜性密切相關(guān)。研究入侵對病毒致病機(jī)制的深入理解具有重要意義。目前，對坦布蘇病毒入侵方面的研究報(bào)道較少，故本研究利用針對不同內(nèi)吞途徑的特異性化學(xué)阻斷劑初步探討坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞的機(jī)制，為深入闡明坦布蘇病毒的入侵機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)，也為病毒的防控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 毒株和細(xì)胞

試驗(yàn)所用坦布蘇病毒JS804株和DF-1細(xì)胞均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和耗材

氯丙嗪（CPZ）、dynasore、甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）、genistein和EIPA均，購自Sigma公司;胎牛血清，購自Hyclone公司;DMEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司;RNA抽提試劑盒，購自Axygen公司;MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購自Takara公司;SYBR qPCR Master Mix，購自諾唯贊公司;CCK-8試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 細(xì)胞預(yù)處理和病毒感染試驗(yàn)

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng) DF-1 細(xì)胞接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37? ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。待細(xì)胞密度長至90%時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，用滅菌PBS洗滌3次，分別加入不同入侵途徑阻斷劑（甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）、氯丙嗪（CPZ）、genistein、dynasore和EIPA），同時(shí)設(shè)不處理空白對照，作用1 h后，以MOI=0.01的劑量接種坦布蘇病毒，37 ℃孵育1 h，吸棄接種液，每孔加入1.5 mL含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染 24 h 后收集細(xì)胞病毒液，進(jìn)行病毒滴度和核酸檢測。

1.4 細(xì)胞預(yù)處理和病毒吸附及內(nèi)吞試驗(yàn)

按“1.3”節(jié)步驟準(zhǔn)備12孔板DF-1單層細(xì)胞并用藥物進(jìn)行預(yù)處理，以MOI=5的劑量接種坦布蘇病毒，4 ℃孵育1 h，或吸棄接種液，用預(yù)冷的滅菌PBS洗滌3次后直接收集細(xì)胞進(jìn)行病毒核酸檢測（吸附試驗(yàn)）;或?qū)⒔臃N細(xì)胞移置37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后吸棄接種液，預(yù)冷滅菌PBS洗滌3次，用 1 mg/mL 蛋白酶K在4 ℃條件下作用45 min后收集細(xì)胞進(jìn)行病毒核酸檢測（內(nèi)吞試驗(yàn)）。

1.5 病毒滴度測定

用噬斑計(jì)數(shù)法進(jìn)行病毒滴度的測定。用預(yù)冷的DMEM基礎(chǔ)液將收集樣品進(jìn)行10倍系列倍比稀釋，接種至預(yù)先制備的12孔板單層BHK-21細(xì)胞，置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，吸棄孔內(nèi)接種液，每孔加入1.5 mL含4% FBS的2%低熔點(diǎn)瓊脂與 2×DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液等體積混合的上層瓊脂培養(yǎng)基，4 ℃放置10 min，使低熔點(diǎn)瓊脂冷卻，置 37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，每孔加入 0.5 mL 終濃度為0.02%中性紅染液至上層瓊脂，37 ℃放置12 h后觀察結(jié)果，記錄噬斑數(shù)，計(jì)算病毒滴度。

1.6 相對熒光定量PCR檢測病毒核酸表達(dá)

按RNA抽提試劑盒說明書提取收集細(xì)胞樣品RNA并利用MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以獲取的cDNA為模板，用SYBR Green染料法進(jìn)行相對熒光定量PCR的擴(kuò)增。坦布蘇病毒擴(kuò)增上下游引物分別為：5′-GTGAGATCTTACTGCTATGAG-3′和5′-ACTTGGCACATGTC TGTATGC-3′;細(xì)胞內(nèi)參基因actin擴(kuò)增上下游引物分別為：5′-TTGGAGGCTCTATCCTGG-3′和5′-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 變性10 s，60 ℃ 退火30 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCT法計(jì)算病毒基因的相對表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞活性試驗(yàn)

用CCK-8法檢測藥物對細(xì)胞活性的影響。制備96孔板DF-1單層細(xì)胞，用不同濃度的藥物 37 ℃ 處理2 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，設(shè)置加處理藥物、CCK-8溶液和相應(yīng)培養(yǎng)液但不加細(xì)胞的孔作為空白對照，孵育1 h后，測定450 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞依賴網(wǎng)格蛋白

為觀察網(wǎng)格蛋白對坦布蘇病毒感染DF-1細(xì)胞的影響，本試驗(yàn)分別用不同濃度的網(wǎng)格蛋白抑制劑CPZ（0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞后感染病毒，用噬斑計(jì)數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度，同時(shí)用qRT-PCR測定病毒核酸表達(dá)。由圖1可知，與對照組相比，抑制劑CPZ處理細(xì)胞后可顯著降低病毒滴度和病毒核酸相對表達(dá)量，并且呈劑量依賴性;吸附和內(nèi)吞試驗(yàn)結(jié)果顯示，CPZ可顯著抑制病毒的內(nèi)吞，對病毒的吸附無明顯影響。提示坦布蘇病毒通過網(wǎng)格蛋白依賴內(nèi)吞途徑入侵DF-1細(xì)胞。

2.2 坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞不依賴于小窩蛋白

為觀察小窩蛋白對坦布蘇病毒感染DF-1細(xì)胞的影響， 本試驗(yàn)分別使用不同濃度的小窩蛋白抑制劑genistein（0、100、200、400 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞后感染病毒，用噬斑計(jì)數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度。由圖2可知，與對照組相比，不同濃度genistein處理細(xì)胞后，病毒的滴度無顯著差異，表明坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞不依賴小窩蛋白。

2.3 坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞不依賴于膽固醇

為觀察細(xì)胞膜膽固醇對坦布蘇病毒感染DF-1細(xì)胞的影響，本試驗(yàn)分別用不同濃度的膽固醇抽提劑MβCD（0.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mmol/L）預(yù)處理細(xì)胞后感染病毒，用噬斑計(jì)數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度。由圖3可知，與對照組相比，不同濃度MβCD處理細(xì)胞后，病毒的滴度無顯著差異，表明坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞不依賴于膽固醇。

2.4 坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞依賴于動力蛋白

為觀察動力蛋白對坦布蘇病毒感染DF-1細(xì)胞的影響，本試驗(yàn)分別用不同濃度的動力蛋白抑制劑dynasore（0、20、50、100 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞后感染病毒，用噬斑計(jì)數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度，同時(shí)用qRT-PCR測定病毒核酸表達(dá)。由圖4可知，與對照組相比，抑制劑dynasore處理細(xì)胞后可顯著降低病毒滴度和病毒核酸相對表達(dá)量，并且呈劑量依賴性。吸附和內(nèi)吞試驗(yàn)結(jié)果顯示，dynasore可顯著抑制病毒的內(nèi)吞，對病毒的吸附無明顯影響。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞依賴于動力蛋白。

2.5 坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞不依賴于胞吞途徑

為觀察坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞是否依賴于胞吞途徑，試驗(yàn)分別使用不同濃度的胞吞途徑抑制劑EIPA（0、10、20、50 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞后感染病毒，用噬斑計(jì)數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度。由圖5可知，與對照組相比，不同濃度EIPA處理細(xì)胞后，病毒的滴度無顯著差異，表明坦布蘇病毒入侵DF-1細(xì)胞不依賴于胞吞途徑。

3 討論與結(jié)論

入侵是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞并建立有效感染的第一步。目前，研究表明，大多數(shù)動物病毒能夠利用宿主細(xì)胞的多種內(nèi)吞方式完成入侵過程。其中網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞是一種經(jīng)典的內(nèi)吞途徑，也是許多病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑，如乙腦病毒入侵BHK-21細(xì)胞[13]，豬瘟病毒入侵ST細(xì)胞[14]，牛腹瀉病毒入侵MDBK細(xì)胞[15]等。通常情況下，病毒與細(xì)胞受體結(jié)合后招募網(wǎng)格蛋白，使包膜內(nèi)陷成包被小凹，隨之形成骨架為網(wǎng)格蛋白的包被囊泡，病毒被包裹其中。在動力蛋白參與下，囊泡頸部膜斷裂，囊泡脫離細(xì)胞膜，將病毒遞送到內(nèi)體中[8]。小窩依賴的內(nèi)吞也是病毒入侵細(xì)胞的常見途徑，比如乙腦病毒入侵神經(jīng)細(xì)胞[11]，埃博拉病毒入侵骨肉瘤細(xì)胞[16]等。細(xì)胞膜上的小窩由膽固醇、鞘脂及小窩蛋白組成，也是脂笩的一種形式。小窩依賴的內(nèi)吞過程同樣需要動力蛋白的參與，使內(nèi)陷的小泡脫離胞膜[8]。此外，巨胞飲作為細(xì)胞的一種重要生理過程，一般由生長因子誘導(dǎo)引起細(xì)胞膜褶皺形成巨飲胞體，主要介導(dǎo)某些大分子物質(zhì)的內(nèi)吞，也可以幫助某些病毒完成入胞過程，比如牛痘病毒、單純皰疹病毒1型等[8]。同時(shí)，病毒的入侵需要諸多宿主元件的參與，除上述動力蛋白外，還有肌動蛋白、酪氨酸激酶、膽固醇等等。文獻(xiàn)報(bào)道，膽固醇在黃病毒的入侵過程中發(fā)揮重要作用，比如甲基-β-環(huán)糊精去除胞膜膽固醇可顯著抑制西尼羅病毒和登革熱病毒在一些哺乳動物細(xì)胞上的入侵效率[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，分別用網(wǎng)格蛋白組裝抑制劑氯丙嗪和動力蛋白抑制劑dynasore預(yù)處理DF-1細(xì)胞后，均能顯著抑制坦布蘇病毒的感染，且主要作用于病毒的內(nèi)吞過程，而小窩蛋白抑制劑、膽固醇抽提劑和巨胞飲抑制劑處理細(xì)胞則對病毒的感染無明顯影響，提示坦布蘇病毒主要利用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵DF-1細(xì)胞，并依賴于動力蛋白。

病毒入侵是一個(gè)復(fù)雜而多樣化的過程，病毒可同時(shí)利用多種內(nèi)吞途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞，同一病毒可通過不同途徑進(jìn)入不同細(xì)胞，不同病毒在同一細(xì)胞上的入侵方式也各有差異。本試驗(yàn)初步研究了坦布蘇病毒在DF-1細(xì)胞上的入侵途徑，但對于病毒為何選擇這種途徑與如何利用這種途徑的具體機(jī)制以及可能存在的其他入侵途徑等需要進(jìn)一步深入研究。

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