劉麗辰，黃秀紅，阮懌航，張祿煥，趙璇，林金科

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400）

茶色素[1]（tea pigment，TP）是從茶葉中提取的一類水溶性酚性色素，包括茶黃素（theaflavin，TF）、茶紅素（thearubigin，TR）、茶褐素（theabrownin，TB）等，在茶葉加工過程中，由多酚類物質(zhì)經(jīng)酶促氧化聚合縮合反應(yīng)形成的水溶性有色氧化產(chǎn)物。茶色素是具有抗氧化性[2-4]、調(diào)節(jié)神經(jīng)功能[5-6]、抗性血管疾病[7-8]、減肥[9]等眾多保健功效的一類茶葉特有的加工過程中形成的色素。隨著科研水平的不斷發(fā)展，天然色素取代人工合成色素已成為趨勢(shì)[10]，因此如何從茶葉中高效綠色提取茶色素變得十分重要。

亞臨界水（subcritical water，SW）提取是以亞臨界水為提取溶劑，在一定壓力范圍內(nèi)，將水加熱至100℃～374℃時(shí)依然能保持液體狀態(tài)[11]。目前亞臨界條件已廣泛應(yīng)用于食品加工和植物天然產(chǎn)物提取[12-15]。此技術(shù)具有環(huán)境友好、提取效率高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，因此利用亞臨界水提取茶色素能達(dá)到提取過程綠色環(huán)保，且操作方便的目的[16]。本研究以紅茶為對(duì)象，通過亞臨界水提取其中的茶色素，通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化茶色素提取工藝，為茶葉天然產(chǎn)物提取的產(chǎn)業(yè)鏈提供一個(gè)技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅茶：福建省安溪縣惜緣茶業(yè)；DPPH、乙酸乙酯、95%乙醇、無水乙醇、正丁醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；超氧陰離子試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)儀器

恒溫水浴鍋（HH-6）：國(guó)華電器有限公司；水浴搖床（MQS-30S）：旻泉儀器有限公司；可見分光光度計(jì)（721N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9123A）：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-12）：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；AVATAR370型傅里葉紅外光譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶色素的提取

將紅茶樣品粉碎過60目篩，放入-20℃冰箱備用。稱取紅茶粉末3.000 g，加入含有120 mL水的亞臨界反應(yīng)釜中，料液比為1∶40（g/mL），設(shè)置提取條件為100 r/min、160℃、30 min，過濾后得上清液，記為SW組茶色素。以普通沸水提取作為對(duì)照，記為BW組茶色素。

1.3.2 總茶色素含量的測(cè)定

參照Roberts等[17]的系統(tǒng)分析法，進(jìn)行茶葉提取液中TF、TR、TB的含量的測(cè)定，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。其中總茶色素含量計(jì)算方式如下。

TP/%=TF+TR+TB

式中：TP表示總茶色素含量，%；TF表示茶黃素含量，%；TR表示茶紅素含量，%；TB表示茶褐色含量，%。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

對(duì)亞臨界水提法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)。分別考察料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]、亞臨界提取溫度（120、130、140、150、160 ℃）和亞臨界提取時(shí)間（5、10、15、20、25 min）對(duì)茶湯中茶色素含量的影響。

1.3.4 亞臨界水提取茶色素的響應(yīng)面試驗(yàn)

以總茶色素含量（TP）、茶黃素含量（TF）、茶紅素含量（TR）、茶褐素含量（TB）為響應(yīng)值。采用三水平三因素的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究利用亞臨界水提取茶色素的最佳提取參數(shù)。選取A料液比、B提取溫度、C提取時(shí)間3個(gè)因素，并設(shè)置3個(gè)水平，以-1、0、+1編碼，具體水平因素設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and horizontal design

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析

取1 mg干燥的茶色素樣品粉末與100 mg KBr固體粉末一起研磨，壓片機(jī)壓片，放入AVATAR370型的傅里葉紅外光譜儀中，在4 000 cm-1～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，觀察峰譜情況。

1.3.6 總茶色素的體外抗氧化活性研究

采用DPPH·比色法進(jìn)行測(cè)定，參照Yang等[18]方法，檢測(cè)DPPH自由基的清除率；利用超氧陰離子試劑盒檢測(cè)總茶色素的超氧陰離子的清除率。以普通沸水提取的總茶色素的抗氧化活性做對(duì)照，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.7 茶粉物理形態(tài)觀察

取適量經(jīng)亞臨界水處理后經(jīng)冷凍干燥的固態(tài)茶色素粉粒和沸水提取后的茶粉固態(tài)茶色素粉粒，通過陰極噴涂將樣品金覆蓋，在掃描電鏡上放大1 000倍，觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析，運(yùn)用Excel 2010進(jìn)行表格的繪制，Prism進(jìn)行圖像繪制，同時(shí)利用Design-Expert 10軟件進(jìn)行回歸模型建立、方差分析及繪制響應(yīng)曲面圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取劑提取茶色素的含量比較

茶色素在不同提取劑中的溶解性不同，得到的色素溶液顏色也不同。以沸水提取得到的茶色素溶液顏色為深棕色，而在亞臨界條件下水提取得到的色素顏色稍淺為棕色，但溶液較濃且不黏稠。檢測(cè)其TF、TR、TB、TP含量結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取劑提取的茶色素含量Fig.1 The content of tea pigment extracted by different extraction agent

由圖1可知，SW組4種茶色素含量高于普通沸水提取法，且TF、TR、TB的含量增加較為明顯。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)茶色素含量的影響

不同料液比提取對(duì)茶色素含量的影響見圖2。

圖2 不同料液比提取的茶色素含量Fig.2 The content of tea pigment extracted by different solidliquid ratio

由圖2可知，反應(yīng)前期，隨著溶劑增加，茶黃素有增大的趨勢(shì)，在料液比為 1∶20（g/mL）～1∶30（g/mL）時(shí)有降低的趨勢(shì)，而后繼續(xù)上升，在料液比為1∶50（g/mL）時(shí)，茶黃素含量達(dá)最高為2.9%。茶紅素和茶褐素的含量也隨溶劑增加而逐漸增大，在料液比1∶40（g/mL）時(shí)含量分別達(dá)到12.49%、16.22%。這可能是由于在溶劑較少時(shí)，茶色素溶解較少，使得各種茶色素提取率變化不大；隨著溶劑增加，茶粉與溶劑的接觸面積增大，茶色素的溶解量增加，從而所得到的各種茶色素含量升高。繼續(xù)增加溶劑，部分茶色素降解，導(dǎo)致提取率降低。所以最適料液比為1：40（g/mL），此時(shí)總茶色素含量為30.04%。

2.2.2 亞臨界水提取溫度對(duì)茶色素含量的影響

提取溫度的改變可以通過影響原料黏度和溶解速度來影響提取率，不同提取溫度提取的茶色素含量見圖3。

圖3 不同提取溫度提取的茶色素含量Fig.3 The content of tea pigment extracted by the different temperature of extraction

由圖3可知，在120℃～160℃之間，隨著溫度的升高茶黃素含量先減小后增大又減小，在150℃時(shí)達(dá)到2.39%。隨著溫度升高茶紅素含量有略微升高再下降的趨勢(shì)，在130℃時(shí)達(dá)到15.94%。茶褐素含量在120℃～140℃時(shí)變化不大，在溫度大于140℃后含量明顯下降，猜測(cè)其變化原因是由于非提取成分形成泡沫包裹在原料的表面，降低提取率，將溫度調(diào)至合適的范圍可以加速分子的運(yùn)動(dòng)從而提高溶解度，或者由于茶色素不耐高熱，開始降解所致。因此選擇140℃為最適提取溫度。

2.2.3 亞臨界水提取時(shí)間對(duì)茶色素含量的影響

不同提取時(shí)間提取的茶色素含量見圖4。

圖4 不同提取時(shí)間提取的茶色素含量Fig.4 The content of tea pigment extracted by different extraction time

由圖4可以看出，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，茶黃素的含量呈先升高后降低趨勢(shì)，在提取時(shí)間為20 min時(shí)茶黃素含量為2.05%。隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)茶紅素和茶褐素也是呈先升高后降低的波動(dòng)變化趨勢(shì)。在10 min～15 min之間茶紅素和茶褐素含量變化起伏不大。推測(cè)在提取15 min左右提取環(huán)境達(dá)到固液相平衡，在平衡前適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)提取時(shí)間有利于更多成分析出；而隨著時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，茶色素開始降解，導(dǎo)致提取率下降。因此選擇15 min為最適提取時(shí)間。

2.3 亞臨界水提取茶色素的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

采用三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以料液比、提取溫度、提取時(shí)間為獨(dú)立變量，以TF、TR、TB、TP的含量為響應(yīng)變量的17個(gè)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與茶色素含量Table 2 Response surface experiment design and tea pigment content

2.3.1 茶黃素及茶紅素的Box-Behnken試驗(yàn)

通過對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到茶黃素（TF）和茶紅素（TR）含量的二階方程式如下。

YTF=1.08-0.52A+0.081B-0.077C+0.3AB+0.26AC+0.063BC+0.29A2-0.28B2-0.17C2。

YTR=11.12-2.13A+0.31B-0.086C+0.98AB+0.80AC+0.36BC+1.33A2-1.18B2-0.97C2。

方差分析常被用于評(píng)估獨(dú)立變量和響應(yīng)變量之間的關(guān)系以及提取方法的最佳條件，茶黃素和茶紅素的結(jié)果見表3。

表3 茶黃素及茶紅素含量方差分析Table 3 Variance analysis of theaflavin and thearubigin contents

由表3可知，茶黃素的模型P值達(dá)到極顯著水平且R2為0.968 7，說明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)成功。對(duì)茶紅素而言，模型的F值為25.14，P<0.01說明模型達(dá)到極顯著水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。茶紅素的失擬項(xiàng)P值為0.156為不顯著，R2為0.97，進(jìn)一步表明該模型選擇合適。在TR方差分析中，各項(xiàng)的P值表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，從表中可以看出一次項(xiàng)A料液比和交互項(xiàng)AB的P值都達(dá)到極顯著水平，說明其對(duì)茶紅素含量影響較大。

響應(yīng)面3D圖能直觀的看出各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的交互作用，各因素對(duì)茶黃素和茶紅素響應(yīng)面3D圖見圖5。

圖5 各因素對(duì)茶黃素和茶紅素響應(yīng)面3D圖Fig.5 Theaflavin and thearubigin response surface 3D diagram

由圖5a～圖5c中看出，當(dāng)茶粉成分越低時(shí)，茶黃素的含量逐漸升高，各項(xiàng)因子對(duì)茶黃素提取的作用影響：料液比>提取溫度>提取時(shí)間。在此體系茶黃素最優(yōu)提取條件：料液比 1∶50（g/mL），提取溫度 144.3 ℃，提取時(shí)間11.46 min。

由圖5d～圖5f可知，隨著溶劑的增加，茶紅素的含量逐漸升高，這可能是由于提取溶劑太少時(shí)，茶粉與提取溶劑接觸不充分、不均勻，影響TR析出。各項(xiàng)因子對(duì)茶紅素含量的影響順序?yàn)榱弦罕?提取溫度>提取時(shí)間，與茶黃素趨勢(shì)大致相同。提取時(shí)間對(duì)提取率影響最小，與前人結(jié)果相似[19-20]。在此體系中茶紅素最優(yōu)提取條件：料液比1∶50（g/mL），提取溫度132.72℃，提取時(shí)間9.74 min。

2.3.2 茶褐素及總茶色素的Box-Behnken試驗(yàn)

通過對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到茶褐素（TB）和總茶色素（TP）含量的二階方程式如下。

YTB=12.14-2.23A+0.099B+0.21C-0.23AB+0.10AC-0.29BC+0.98A2-1.91B2-0.44C2。

YTP=23.80-4.38A+0.50B-0.13C+1.07AB+1.05AC+0.54BC+2.94A2-2.71B2-1.30C2。

茶褐素和總茶色素的方差分析結(jié)果見表4。

表4 茶褐素及總茶色素含量的方差分析Table 4 Variance analysis of theabrownin and total tea pigment contents

茶褐素模型的F值為8.86，P<0.01且失擬項(xiàng)P值為0.084 6不顯著，R2值為0.919 3，表明該模型擬合成功。從表中得到一次項(xiàng)A料液比和二次項(xiàng)B2都存在極顯著差異。其中料液比、提取溫度、提取時(shí)間3者的交互作用對(duì)茶褐素含量影響不大?？偛枭兀═P）模型的F值為16.49，P<0.001，模型達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P值為0.056 7不顯著，R2為0.955，該模型擬合成功。其中一次項(xiàng)A料液比和二次項(xiàng)A2、B2，都達(dá)到極顯著水平，說明其影響趨勢(shì)與茶褐素相似。

各因素對(duì)茶褐素和總茶色素的響應(yīng)面3D圖見圖6。

圖6 各因素對(duì)茶褐素和總茶色素的響應(yīng)面3D圖Fig.6 Theabrownin and total tea pigment response surface 3D diagram

由圖6可知，由于TB含量的變化影響了TP含量的變化，因此TP圖形的變化趨勢(shì)與TB相似。隨著提取溫度的增加，TB含量和TP含量都有逐漸降低的趨勢(shì)，可能因?yàn)闇囟冗^高茶色素?zé)崦魧?dǎo)致茶色素溶解減少。各項(xiàng)因子對(duì)TB含量和TP含量的影響為料液比>提取溫度>提取時(shí)間。響應(yīng)面試驗(yàn)選擇提取茶褐素的最佳提取條件為料液比為1∶50（g/mL），提取溫度為140℃，提取時(shí)間為11.57 min；而Box-Behnken試驗(yàn)選擇提取總茶色素的最佳提取條件：料液比為1∶50（g/mL），提取溫度為136.96℃，提取時(shí)間為10.16 min。

根據(jù)本研究目的，提取3種茶色素的含量最大化和最大限度的得到總茶色素，響應(yīng)面試驗(yàn)選擇TF、TR、TB和TP的最大值，軟件分析得到的提取條件：料液比1∶50（g/mL），提取溫度 138.1 ℃，提取時(shí)間 9.87 min。

2.3.3 結(jié)果驗(yàn)證

通過響應(yīng)面試驗(yàn)，以篩選出來的提取條件進(jìn)行茶色素提取，預(yù)測(cè)能得到的TF含量為1.23%、TR含量為14.85%、TB含量為14.91%、TP含量為30.98%。通過實(shí)際提取后對(duì)提取液進(jìn)行檢測(cè)得到TF含量為1.31%、TR含量為14.37%、TB含量為13.34%、TP含量為29.02%。與模型預(yù)測(cè)值大致相同，說明模型擬合成功。

2.4 總茶色素的紅外光譜結(jié)果

2.4.1 普通沸水提取總茶色素得紅外光譜掃描結(jié)果

總茶色素在4 000 cm-1～0范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果見圖7。

圖7 BW組總茶色素紅外光譜圖Fig7 Infrared spectra of BW total tea pigment

由圖7可知，3 361 cm-1處有吸收峰，說明是由OH的伸縮振動(dòng)引起的；1 704 cm-1處有吸收峰，說明是由-C=O 的伸縮振動(dòng)引起的；1 656、1 583、1 458 cm-1有吸收峰，表明結(jié)構(gòu)中可能含苯環(huán)結(jié)構(gòu)；1 337 cm-1處有吸收峰，為O-H鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)；1 166 cm-1處有吸收峰，說明有=C-OH的存在，表明結(jié)構(gòu)中含有含有=C-OH結(jié)構(gòu)。

2.4.2 亞臨界水提總茶色素的紅外光譜掃描結(jié)果

總茶色素在4 000 cm-1～0范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果見圖8。

圖8 SW組總茶色素紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectra of SW total tea pigment

圖8中3384cm-1處有吸收峰，說明是由O-H的伸縮振動(dòng)引起的；1 704 cm-1處有吸收峰，說明是由-C=O的伸縮振動(dòng)引起的；1 655、1 581、1 458 cm-1有吸收峰，表明結(jié)構(gòu)中可能含苯環(huán)結(jié)構(gòu)；1 371 cm-1處有吸收峰，為O-H鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)；1 151 cm-1處有吸收峰，說明有=C-OH的存在，表明結(jié)構(gòu)中含有含有=C-OH結(jié)構(gòu)。

2.5 總茶色素的體外抗氧化性研究結(jié)果

2.5.1 總茶色素對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

體內(nèi)過多的自由基積累會(huì)造成細(xì)胞衰老和組織損傷[21-22]。茶色素為多酚氧化物，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[23-24]。總茶色素對(duì)DPPH自由基清除率見圖9。

圖9 總茶色素對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.9 The clearance of DPPH free radicals by total tea pigment

由圖9可知，總茶色素對(duì)DPPH自由基的清除率呈正相關(guān)，即隨著總茶色素濃度的升高，其DPPH自由基的清除率也隨之升高。當(dāng)總茶色素濃度達(dá)到5 g/mL時(shí)，BW茶色素對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到55.90%，此時(shí)SW的清除率為88.10%。當(dāng)總茶色素濃度為最小值0.5 g/mL時(shí)，SW組茶色素的DPPH自由基清除率已超過50%，此時(shí)BW組對(duì)DPPH自由基的清除率為12.66%。說明SW組提取得到的總茶色素對(duì)DPPH自由基具有較好的清除效果，且優(yōu)于普通沸水提取的茶色素。

2.5.2 總茶色素對(duì)O2-自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

O2-·是生物體內(nèi)氧分子受單一電子還原產(chǎn)物，性質(zhì)活潑，具有很強(qiáng)的氧化性和還原性。其不發(fā)生化學(xué)改變對(duì)生物體沒有危害，但與羥基結(jié)和后的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損壞破壞機(jī)體功能?？偛枭貙?duì)超氧陰離子自由基的清除率見圖10。

圖10 總茶色素對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Fig.10 The clearance of super oxide anion free radicals by total tea pigment

由圖10可知，兩組色素對(duì)O2-自由基的清除效果較為一致。當(dāng)色素濃度為5 g/mL時(shí)SW組對(duì)O2-自由基的清除率達(dá)到39.69%。兩組色素對(duì)O2-自由基的最大清除率都未超過50%。茶色素是茶多酚氧化聚合形成的酚性水溶性色素，其酚羥基活性較之茶多酚有所下降，因此對(duì)O2-自由基的清除率較低，與邢珂慧等[25]研究結(jié)果相似。

2.6 電鏡掃描結(jié)果

沸水提取的總茶色素粉粒和亞臨界水提取的總茶色素粉粒表觀形態(tài)圖如圖11所示。

圖11 不同提取方式提取后的茶粉電鏡掃描結(jié)果Fig.11 SEM results of tea powder extracted by different extraction methods

沸水提取的茶色素為平滑的片狀表面，表面凹凸不平，顆粒之間緊密聚集，而通過亞臨界水提取得到的茶色素粉粒，為不規(guī)則的微孔結(jié)構(gòu)，自身出現(xiàn)空隙，產(chǎn)物疊堆變得疏松，結(jié)構(gòu)變得更疏松，空隙更大色素粉粒分布更均勻。

3 結(jié)論

本研究探索了通過亞臨界水處理得到茶色素的提取方法，并評(píng)估其抗氧化活性，且與沸水提取得到的茶色素生物活性進(jìn)行比較。研究發(fā)現(xiàn)利用亞臨界水能高效綠色的提取得到茶色素成品。通過響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行亞臨界水提取茶色素工藝的優(yōu)化，最終篩選確定亞臨界水提取的最佳條件：料液比為 1∶50（g/mL），提取溫度為138.1℃，提取時(shí)間為9.87 min。SW提取的總茶色素對(duì)的DPPH自由基清除率顯著高于BW組，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。利用亞臨界水提取茶色素表現(xiàn)優(yōu)勢(shì)明顯，亞臨界水在天然產(chǎn)物的提取方面有巨大的潛力。