蘇永成，丁志雯，武波飛，陳靜雯，張唯，張弘彧，房耀維 ，2，劉姝，2*

（1.江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222000）

氨基酸是生物體內(nèi)大量存在的，同時(shí)具有氨基和羧基的雙官能團(tuán)生命小分子配體，是構(gòu)成生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、酶的基本結(jié)構(gòu)單元，能夠?yàn)樯矬w提供生長發(fā)育所需要的養(yǎng)分[1-2]。同時(shí)氨基酸也是一種具有氨基與羧基的天然小分子有機(jī)酸，具有多種特殊官能基團(tuán)和多樣的結(jié)構(gòu)，因此氨基酸在精細(xì)化工、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。鋅主要參與生物的生長、繁殖、免疫、發(fā)育、激素合成及機(jī)體的新陳代謝等，是保證組織、器官和系統(tǒng)正常功能的重要的微量元素[3-4]。鐵是血紅蛋白合成和維持機(jī)體正常生理機(jī)能所必需的微量元素。人體內(nèi)缺乏鋅和鐵元素，會(huì)影響腦垂體和腎上腺的內(nèi)分泌平衡，導(dǎo)致發(fā)育停滯、智力發(fā)育不良、貧血等病癥[5]。氨基酸螯合物是指利用金屬陽離子與氨基酸進(jìn)行反應(yīng)并形成配位鍵，并且金屬陽離子與氨基端和羧基端形成五元環(huán)或六元環(huán)等特殊的環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)，使得整個(gè)環(huán)狀分子內(nèi)趨于電中性[6]。氨基酸鋅和氨基酸鐵作為人和動(dòng)物的鋅、鐵補(bǔ)充劑，生物利用率高，在補(bǔ)充的鋅、鐵的同時(shí)還能補(bǔ)充氨基酸，因此，廣泛用于人體的鋅、鐵營養(yǎng)強(qiáng)化劑和飼料添加劑[7]。另外，氨基酸鋅和氨基酸鐵具有抗氧化和抗菌活性，用于食品的保鮮，延長食品的貨架期[8]。

水果和蔬菜采收后，由于微生物導(dǎo)致的腐敗而造成了巨大損失。目前，我國果蔬的腐爛損失率在20%左右[9]。使用抗生素和化學(xué)保鮮劑可顯著延長果蔬貨架期，但是存在高殘留、不易降解、導(dǎo)致細(xì)菌耐藥增加、危害公共衛(wèi)生安全等問題[10]。氨基酸鋅和氨基酸鐵綠色安全，在具有食品保鮮功能的同時(shí)，又具有營養(yǎng)強(qiáng)化功能，在果蔬保鮮方面極具應(yīng)用潛力[11]。目前果蔬保鮮常采用涂膜保鮮，在果蔬表面形成一層薄膜，可以阻止微生物對(duì)果蔬的侵害，降低果蔬呼吸強(qiáng)度，延緩果蔬的生理代謝活動(dòng)和營養(yǎng)的損失，達(dá)到延長果蔬貨架期的目的。但是，目前對(duì)復(fù)合氨基酸鋅和氨基酸鐵的抗菌活性和抗氧化活性的系統(tǒng)研究尚鮮有報(bào)道。

本研究以人體必需8種氨基酸作為配體，采用水體系合成法制備復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵，水體系合成法是螯合方法中最常用的一種方法，其螯合工藝一般為：氨基酸+金屬鹽→溶解→調(diào)節(jié)pH值→螯合→過濾→濾渣干燥→產(chǎn)品。并測定復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵對(duì)引起果蔬腐敗中常見細(xì)菌、酵母菌和霉菌的抗菌活性和DPPH·、O2-·、·OH的清除能力，為復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵作為果蔬保鮮劑的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus AS1.1846）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus AS1.2465）、大腸桿菌（Escherichia coli AS1.487）、黑曲霉（Aspergillus niger AS3.350）、釀酒酵母（Sacc haromyces cerevisiaeAS2.114）、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum AS3.3703）：中國普通微生物菌種保藏中心；黃曲霉（Asper-gillus flavus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis AS1.140）：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏；長形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、魯氏結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）：江蘇海洋大學(xué)海洋微生物酶工程研究室分離保藏。

復(fù)合氨基酸（L-賴氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；七水合硫酸鋅、七水合硫酸亞鐵、氫氧化鈉、無水乙醇、冰乙酸（均為分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；DPPH試劑：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗壞血酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羥基自由基試劑盒、超氧陰離子自由基試劑盒：南京建成生物工程研究所。

LB 培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0，121 ℃ 滅菌 20 min；PD 培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9245A型鼓風(fēng)干燥箱：上海易研實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；iMark型酶標(biāo)儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；DK-80型電熱恒溫水槽、THZ-103B型恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AA240FS原子吸收分光光度計(jì)：美國瓦里安公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵的制備

復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵制備工藝參考文獻(xiàn)[12-14]等報(bào)道的制備方法并加以改進(jìn)。分別稱取適量復(fù)合氨基酸（L-賴氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸，復(fù)合氨基酸濃度為0.1 mol/L），加入到蒸餾水中，加熱攪拌使其完全溶解，得到飽和溶液。按照摩爾比2∶1與硫酸鋅或者硫酸鐵（濃度為0.05 mol/L）混合，用6 mol/L氫氧化鈉或1 mol/L硫酸調(diào)節(jié)溶液酸堿度，pH7.0～7.5，在75℃水浴下螯合1 h。5 000 r/min離心10 min后，收集沉淀。采用有機(jī)溶劑沉淀法分離螯合物，按照螯合濃縮液∶有機(jī)溶劑1∶10的體積比加入無水乙醇，5 000 r/min離心10 min后收集沉淀，在60℃干燥箱中烘干，得到復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵。

1.3.2 鋅、鐵元素的測定

配制不同濃度的鋅和鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，將鋅和鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液按照質(zhì)量濃度由低到高的順序分別導(dǎo)入火焰原子化器，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；將復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵溶解，將空白溶液、復(fù)合氨基酸鋅溶液和復(fù)合氨基酸鐵溶液分別導(dǎo)入火焰原子化器，測得金屬離子的含量[15]。螯合率計(jì)算公式如下。

螯合率/%=（螯合態(tài)金屬離子含量/金屬離子總含量）×100

1.3.3 菌懸液的制備

將受試菌進(jìn)行斜面活化后，用接種環(huán)挑取菌體，通過無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整菌液濃度為1×107cfu/mL。

1.3.4 復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵抗菌活性的測定

參照Dubey等[16]所述的試管二倍稀釋法，稍作修改，進(jìn)行各受試樣品最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定。樣品為復(fù)合氨基酸、復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵，在無菌操作臺(tái)中對(duì)試管按1～8號(hào)依次編號(hào)，首先在每支試管中加入3 mL無菌LB或PD液體培養(yǎng)基，在1號(hào)管加入3 mL樣品溶液，充分混勻后吸取3 mL加入2號(hào)管中混勻，按照此法依次稀釋到6號(hào)管，棄去6號(hào)管溶液3 mL，此時(shí)各試管中樣品濃度依次為 2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 125 mg/mL，接下來每個(gè)試管依次加入菌懸液0.1 mL。7號(hào)管加入0.1 mL菌懸液，不加樣品液作為陽性對(duì)照管。8號(hào)管不加樣品液也不加菌懸液作為陰性對(duì)照管。細(xì)菌37℃振蕩培養(yǎng)1 d，酵母菌30℃振蕩培養(yǎng)1 d，霉菌28℃振蕩培養(yǎng)2 d。每一濃度梯度做3組平行試驗(yàn)，以陽性對(duì)照管液體渾濁、陰性對(duì)照管液體澄清為標(biāo)準(zhǔn)，觀察試管液體是否為透明。再利用酶標(biāo)儀在600 nm波長下檢測細(xì)菌和酵母菌在不同濃度梯度樣品中的生長情況，綜合肉眼觀察得到的結(jié)果，最終判定MIC。

1.3.5 復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵抗氧化性的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

采用DPPH比色法進(jìn)行測定[17-18]。樣品為復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵，取離心管3支，編號(hào)1～3，1號(hào)管加2 mL樣品溶液和2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，振蕩混勻后，暗處、室溫25℃條件下靜置反應(yīng)30 min，測OD517，記作A1；2號(hào)管加2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇混勻，測OD517，記作A2；3號(hào)管加2 mL無水乙醇和2 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液混勻，測OD517，記作A3。以不同質(zhì)量濃度的VC水溶液作陽性對(duì)照，吸取不同濃度樣品溶液均按以上操作分別測定DPPH自由基清除能力。自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100。

1.3.5.2 超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH）的清除能力測定

吸取不同質(zhì)量濃度的復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵溶液，采用羥基自由基試劑盒和超氧陰離子自由基試劑盒的方法，分別測定其自由基清除能力。計(jì)算自由基清除率[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行差異性顯著分析，利用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵螯合率的測定

復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵的螯合率見表1。

表1 復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵的螯合率Table 1 Chelation rates of compound amino acid zinc and compound amino acid iron

由表1可知，復(fù)合氨基酸鋅中鋅含量占12.83%，螯合率為81.27%。復(fù)合氨基酸鐵中鐵含量為11.29%，螯合率為68.19%。周燕芳等[20]報(bào)道使用中性蛋白酶對(duì)魚蛋白粉進(jìn)行酶解，以酶解后得到的氨基酸與鋅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液螯合制備復(fù)合氨基酸鋅，所得螯合率為83.58%。也有報(bào)道以花生粕為原料制備復(fù)合氨基酸螯合鋅，螯合率83.46%[21]。廉宜君等[22]利用棉籽粕復(fù)合氨基酸與氯化亞鐵進(jìn)行螯合制備復(fù)合氨基酸鐵螯合物，螯合率為73.76%。螯合率的不同可能是因?yàn)榘被崤c金屬離子配位比、體系pH值、螯合反應(yīng)溫度及時(shí)間等因素有關(guān)。

2.2 復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵抗菌活性的測定分析

通過試管二倍稀釋法測定了復(fù)合氨基酸、復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵對(duì)細(xì)菌、酵母菌和霉菌的MIC，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)合氨基酸、復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵的MIC值Table 2 MIC values of compound amino acid，compound amino acid zinc and compound amino acid iron

由表2可知，復(fù)合氨基酸對(duì)供試菌無顯著抗菌作用。復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵對(duì)B.subtilis、S.aureus均有較好的抗菌效果，MIC均為0.313 mg/mL，二者 對(duì) L.macroides、B.cereus、P.aeruginosa、E.coli、Z.rouxii、S.cerevisiae的 MIC均為 0.625 mg/mL。對(duì) A.flavus、P.expansum、A.niger無顯著抗菌作用。吳菁[23]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合氨基酸鐵、復(fù)合氨基酸鋅對(duì)S.aureus、E.coli的生長有抑制作用，對(duì)S.aureus的MIC分別為0.25、0.25 mg/mL，對(duì)E.coli的 MIC分別為0.5、0.5 mg/mL。對(duì)S.aureus、E.coli的MIC與本文研究結(jié)果相比略低，這可能是因?yàn)椴煌衔镏袖\、鐵含量不同導(dǎo)致的結(jié)果。龔毅等[24]研究報(bào)道甘氨酸鋅、蘇氨酸鋅、蛋氨酸鋅和賴氨酸鋅對(duì)E.coli、B.subtilis、S.aureus具有抗菌活性。甘氨酸鋅、蘇氨酸鋅、蛋氨酸鋅和賴氨酸鋅對(duì)E.coli的MIC 分別為 0.176、0.253、0.272、0.373 mg/mL，對(duì)B.subtilis的 MIC 分別為 0.176、0.253、0.272、0.373 mg/mL，對(duì)S.aureus的MIC分別為0.176、0.253、0.272、0.373mg/mL。

2.3 復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵對(duì)DPPH自由基清除能力

復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵對(duì)DPPH自由基清除能力結(jié)果見圖1。

圖1 復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rates of compound amino acid zinc and iron on DPPH radical

由圖1可以看出，復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵對(duì)DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而增大。質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL～2.5 mg/mL時(shí)，復(fù)合氨基酸鋅對(duì)DPPH自由基清除率由5.79%提高到34.52%，復(fù)合氨基酸鐵對(duì)DPPH自由基的清除率由3.75%提高到30.46%。

2.4 復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力

復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Fig.2 Scavenging rates of compound amino acid zinc and iron on superoxide radical

圖3 復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵對(duì)羥基自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of compound amino acid zinc and iron on hydroxyl radical

由圖2和圖3可知，復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基有一定的清除能力，質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL～2.5 mg/mL范圍內(nèi)，其清除能力逐漸增強(qiáng)。質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，復(fù)合氨基酸鋅對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基清除率達(dá)到23.93%和22.36%，復(fù)合氨基酸鐵對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基清除率達(dá)到20.63%和20.05%，與VC比較而言，復(fù)合氨基酸鋅、復(fù)合氨基酸鐵對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力相對(duì)較弱。

3 結(jié)論

本研究制備了復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵，螯合率分別達(dá)到81.27%和68.19%。測定了復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵對(duì)供試細(xì)菌、酵母菌和霉菌的抗菌活性，復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵對(duì)細(xì)菌和酵母菌具有抗菌活性，其中對(duì)B.subtilis、S.aureus的抑制作用最明顯，MIC均為0.313 mg/mL，而對(duì)霉菌的抗菌作用不顯著。復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基均具清除作用，對(duì)DPPH自由基的清除作用最好，復(fù)合氨基酸鋅和復(fù)合氨基酸鐵的抗氧化能力弱于VC。