蔡穎慧，黃瀟，趙小珍

（1.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006；2.山西省科技資源與大型儀器開(kāi)放共享中心，山西 太原 030006）

農(nóng)藥的使用大幅減少了病蟲(chóng)害的發(fā)生，但農(nóng)藥的廣泛使用也是導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境污染、土壤生物學(xué)質(zhì)量退化的最重要人為因素之一。農(nóng)藥污染不僅改變了土壤的理化性質(zhì)，導(dǎo)致土壤酸化，而且對(duì)土壤微生物、土壤質(zhì)量和可持續(xù)利用具有嚴(yán)重危害［1，2］。土壤真菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分之一，具有分解有機(jī)質(zhì)、土壤酶釋放、抑制病原菌等重要作用，是土壤中氮、碳循環(huán)的必要?jiǎng)恿?。真菌可降解?fù)雜化合物，與作物共生形成菌根，對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)、維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義［3，4］。

阿特拉津又稱(chēng)莠去津，是一種內(nèi)吸選擇性苗前、苗后除草劑，可防除多種一年生禾本科和闊葉雜草，對(duì)某些多年生雜草也有一定抑制作用。由于阿特拉津殺草譜廣，價(jià)格低廉，使用效果好，在很多國(guó)家被廣泛應(yīng)用于玉米、甘蔗、果樹(shù)及谷物類(lèi)作物生產(chǎn)中，是世界產(chǎn)量最大的除草劑之一。阿特拉津的結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，降解速度緩慢，其在土壤中的殘留半衰期為28～440 d。已有研究表明，阿特拉津可明顯降低土壤真菌的數(shù)量，對(duì)土壤真菌功能多樣性和遺傳多樣性產(chǎn)生影響［5－8］。近幾年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，大大拓寬了微生物的研究范圍。Illumina MiSeq第二代測(cè)序技術(shù)，可以更直接地檢測(cè)微生物類(lèi)群，廣泛用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、食品等領(lǐng)域［9－11］。樣本的多樣性分析可反映微生物群落的豐富度和多樣性。

目前對(duì)阿拉特津的研究多集中在降解方面，關(guān)于其對(duì)土壤中真菌多樣性的影響少有研究。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建不同污染濃度的土壤模型，采用高通量測(cè)序技術(shù)，揭示阿特拉津?qū)ι轿鞴茸臃N植區(qū)土壤真菌群落的影響，為進(jìn)一步探討農(nóng)藥對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響提供基礎(chǔ)，對(duì)黃土高原谷子種植過(guò)程中阿拉特津用量及使用后土壤生態(tài)環(huán)境修復(fù)具有一定的理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)地位于山西省陽(yáng)曲縣定點(diǎn)試驗(yàn)田，地勢(shì)平坦，屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫6～9℃，年平均降水量為441.2 mm，無(wú)霜期為164 d左右。土壤類(lèi)型為山西黃土，供試作物為谷子（Setaria italica）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共4個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)小區(qū)面積為33 m2。2017年6月上旬至7月上旬、谷子3～4葉期用38%阿特拉津水懸浮劑噴霧兩次，藥劑用量為2、5、8 L／hm2，對(duì)照處理噴施清水［12］。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 2017年9月，采用五點(diǎn)取樣法采集2～20 cm表層土樣。過(guò)2 mm篩子，去除雜草、碎石等雜質(zhì)，4℃保存待用。部分土樣自然風(fēng)干，用于土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定。每個(gè)樣品3次重復(fù)。土壤pH測(cè)定采用酸度計(jì)法；含水量測(cè)定根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)LY／T1213—1999（烘干法）；有機(jī)質(zhì)的測(cè)定采用重鉻酸鉀消煮－硫酸亞鐵滴定法；有機(jī)氮的測(cè)定采用Bremner酸解法；有效磷的測(cè)定采用浸提－鉬銻抗比色法；速效鉀的測(cè)定采用原子吸收火焰光度法［13］。

1.2.3 土壤DNA的提取及ITS基因測(cè)序 稱(chēng)取0.5 g土壤樣品，采用基因組DNA快速抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取土壤DNA；得到的DNA溶解于50～100μL TE Buffer中，－20℃保存。選擇ITS2可變區(qū)，以5～50 ng DNA為模板，PCR擴(kuò)增真菌ITS rDNA。使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。構(gòu)建DNA文庫(kù)，Qubit和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)合格后，通過(guò)Illumina MiSeq上機(jī)測(cè)序［14］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)高通量測(cè)得的序列進(jìn)行聚類(lèi)，以97%的相似度將序列歸為同一分類(lèi)操作單元OTUs（operational taxonomic units），ITS rDNA進(jìn)行比對(duì)（參考數(shù)據(jù)庫(kù)是Unit數(shù)據(jù)庫(kù)：https：／／unite.ut.ee／），然后對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋分析（Ribosomal Database Project），確定ITS2序列對(duì)應(yīng)真菌，并分析不同物種分類(lèi)水平下各樣本的群落組成?；贠TUs的分析結(jié)果，對(duì)樣本序列隨機(jī)抽樣，采用Qiime 1.9.1計(jì)算土壤真菌α多樣性指數(shù)（Chao1、Shannon、ACE等）。原始數(shù)據(jù)利用Galaxy平臺(tái)（http：／／mem.rcees.ac.cn：8080）進(jìn)行分析，以獲得土壤微生物群落優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的相對(duì)豐度［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試土壤理化性質(zhì)

由表1可知，4種處理的土壤pH值無(wú)顯著差異；除5 L／hm2處理的速效鉀含量外，噴施阿特拉津的土壤含水量和有機(jī)質(zhì)、有效磷、速效鉀、有機(jī)氮含量均低于對(duì)照。

表1 供試土壤理化性質(zhì)

2.2 土壤測(cè)序結(jié)果及真菌α多樣性分析

由表2可知，測(cè)序共獲得325 110個(gè)真菌有效序列，依據(jù)97%的相似度，真菌OTUs數(shù)為358～502。本次測(cè)序的覆蓋率均在99%以上，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果較好地反映了土壤樣本中真菌群落組成的真實(shí)情況。對(duì)照土壤獲得的OTUs數(shù)目最多，其次是2 L／hm2和5 L／hm2，8 L／hm2的最低。Chao1指數(shù)表現(xiàn)為對(duì)照＞5 L／hm2＞2 L／hm2＞8 L／hm2，ACE指數(shù)表現(xiàn)為對(duì)照＞2 L／hm2＞8 L／hm2＞5 L／hm2，結(jié)合Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可知，隨著阿特拉津濃度的增加，土壤真菌多樣性降低，物種豐富度降低。

表2 不同濃度阿特拉津脅迫下土壤真菌α多樣性指數(shù)

利用Venn圖統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中的OTUs數(shù)，可以直觀地顯示噴施不同濃度阿特拉津后土壤真菌組成的差異性和重疊程度。4種土壤樣本共有的OTUs數(shù)為138個(gè)，占各土壤樣本的27%～39%。4種土壤樣本特有的OTUs數(shù)目及其所占比例分別為對(duì)照86個(gè)（17.13%），2 L／hm268個(gè)（14.95%），5 L／hm249個(gè)（13.14%），8 L／hm221個(gè)（5.87%）（圖1）。這表明噴施不同濃度阿特拉津土壤間真菌群落組成相似，但仍存在部分差異。

圖1 不同濃度阿特拉津脅迫下土壤真菌Venn圖

2.3 不同濃度阿特拉津脅迫下土壤真菌群落組成

由圖2可以看出，土壤真菌主要門(mén)類(lèi)為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、接合菌門(mén)（Zygomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）和球囊菌門(mén)（Glomeromycota），5個(gè)門(mén)的相對(duì)豐度分別為61.9%、12.5%、6.8%、1.9%和0.9%，未明確分類(lèi)真菌（unidentified）也占有較高比例（16.2%）。阿特拉津處理組與對(duì)照組相比，接合菌門(mén)相對(duì)豐度變化不大；擔(dān)子菌門(mén)和球囊菌門(mén)的相對(duì)豐度在對(duì)照土壤中高于噴灑阿特拉津的土壤。在黃土高原谷子種植區(qū)，子囊菌為土壤真菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。對(duì)照土壤以及噴灑濃度為2 L／hm2阿特拉津的土壤中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度大于5 L／hm2和8 L／hm2的土壤；對(duì)照土壤中真菌多樣性更為豐富。未明確分類(lèi)真菌中，相對(duì)豐度表現(xiàn)為對(duì)照＜2 L／hm2＜5 L／hm2＜8 L／hm2。

圖2 土壤真菌門(mén)水平下優(yōu)勢(shì)物種的相對(duì)豐度

為深入研究不同濃度阿特拉津脅迫下土壤真菌群落物種組成情況，進(jìn)一步考察了樣品中土壤真菌在綱水平和屬水平的優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度。如圖3所示，4種土壤樣品中真菌綱水平的優(yōu)勢(shì)物種主要有傘菌綱（Agaricomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、錘舌菌綱（Leotiomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、絲孢綱（Hyphomycetes）和球囊菌綱（Glomeromycetes）。4種土壤樣品中，傘菌綱的相對(duì)豐度最高，占所有真菌綱的18.6%～27.7%；其次為糞殼菌綱，相對(duì)豐度占所有真菌綱的14.7%～19.1%；真菌綱水平下優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度對(duì)照＞2 L／hm2＞5 L／hm2＞8 L／hm2。

圖3 土壤真菌綱水平優(yōu)勢(shì)物種的相對(duì)豐度

各土壤樣品中真菌優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度如表3所示。噴施不同濃度阿特拉津的土壤真菌屬水平的相對(duì)豐度差異顯著，10種優(yōu)勢(shì)屬絕大部分屬于子囊菌門(mén)。4種土壤樣品中，青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）相對(duì)豐度最高，可達(dá)到11.71%～20.22%，其次是擬青霉屬（Paecilomyces）。土壤真菌優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度均隨著阿特拉津濃度的增高而降低，但是在較低濃度阿特拉津脅迫下，土壤中漆斑菌屬真菌相對(duì)豐度會(huì)有所提高，2 L／hm2阿特拉津脅迫下，土壤中漆斑菌屬真菌相對(duì)豐度可達(dá)1.86%，5 L／hm2條件下為1.06%，而對(duì)照組、8 L／hm2條件下分別為0.08%和0.05%。

表3 土壤真菌優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度 （%）

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明阿特拉津脅迫會(huì)導(dǎo)致土壤含水量、有機(jī)質(zhì)、有效磷、速效鉀、有機(jī)氮等理化性質(zhì)改變。目前相關(guān)研究已證實(shí)，除草劑的長(zhǎng)期使用對(duì)速效磷、速效鉀、速效氮、有機(jī)質(zhì)含量均有影響，而土壤理化性質(zhì)改變又會(huì)進(jìn)一步影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［16－18］。對(duì)照土壤真菌多樣性指數(shù)高，說(shuō)明對(duì)照土壤中真菌多樣性更為豐富。分析其原因，一方面由于對(duì)照不噴灑阿特拉津，雜草生長(zhǎng)相對(duì)旺盛，更具有多樣性。雜草是加強(qiáng)地上地下生態(tài)系統(tǒng)的密切聯(lián)系者，雜草多樣性一定程度上改變了土壤碳氮比，從而進(jìn)一步影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［19］。另一方面，由于避免了農(nóng)藥的使用，本身降低了農(nóng)藥對(duì)土壤部分真菌的毒害，使其能夠更好地利用土壤中易降解部分及養(yǎng)分，從而促進(jìn)其增殖，同時(shí)間接影響其他土壤真菌［20］。

在低濃度阿特拉津脅迫下，谷子種植區(qū)土壤中漆斑菌屬真菌相對(duì)豐度有所提高。漆斑菌多寄生、腐生，能夠產(chǎn)生膽紅素氧化酶，在受到環(huán)境污染后可產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)，導(dǎo)致活性增加。較低濃度的阿特拉津誘導(dǎo)漆斑菌活性的提高，從而提高了漆霉菌屬在土壤中的優(yōu)勢(shì)度和生態(tài)位，增加了其相對(duì)豐度［21］。

在一定范圍內(nèi)，阿特拉津噴灑濃度越高，土壤真菌豐度和多樣性越低；阿特拉津可導(dǎo)致土壤中真菌的豐富度和群落多樣性降低，但不會(huì)改變土壤中優(yōu)勢(shì)真菌種類(lèi)。本研究可為今后探討除草劑對(duì)土壤及真菌群落結(jié)構(gòu)的影響提供依據(jù)。