李瑞娟，李如美*，梁慧，房鋒，白元良，梁林，馮義志，潘金菊，崔淑華，于建壘，劉同金

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250033；3.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266002）

我國特色小作物種類多，食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，在出口貿(mào)易和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。但中國針對(duì)這些小作物登記的農(nóng)藥產(chǎn)品嚴(yán)重匱乏，農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)極為不足，農(nóng)藥在小作物中的殘留消解和安全性使用研究較少，嚴(yán)重制約小作物的發(fā)展。研究啶酰菌胺在代表性小作物上的殘留和安全性使用，對(duì)改善小作物亂用藥和無藥可用的局面、完善中國農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)體系、維護(hù)小作物產(chǎn)品安全有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。美國、歐盟和日本等組織和國家很早就重視小作物上農(nóng)藥的登記與管理，提出根據(jù)農(nóng)作物形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和農(nóng)藥殘留分布規(guī)律的不同，將作物進(jìn)行分類，選取典型代表作物進(jìn)行試驗(yàn)，是一條解決小作物農(nóng)藥登記和MRL標(biāo)準(zhǔn)的有效途徑［1］。

啶酰菌胺通用名稱boscalid，化學(xué)名稱2－氯－N－（4′－氯聯(lián)苯－2－基）煙酰胺，是巴斯夫公司開發(fā)的廣譜性煙酰胺類殺菌劑，主要用于蔬菜、果樹和谷物灰霉病、白粉病、莖腐病等多種病害的防治［2－4］。目前，國內(nèi)外報(bào)道了啶酰菌胺在草莓、黃瓜、番茄和葡萄等作物上的殘留及消解動(dòng)態(tài)［5－8］，以及啶酰菌胺在馬鈴薯、豆瓣菜、葡萄、黃瓜等作物上的殘留及膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［9－12］。有關(guān)啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、大蒜3種代表性小作物中的殘留特征及膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究尚未見報(bào)道。

本研究通過1年6地的田間殘留試驗(yàn)，利用QuEChERS方法結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS／MS）法，對(duì)苦瓜、韭菜、大蒜樣品中啶酰菌胺進(jìn)行檢測(cè)，研究啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、大蒜中的殘留動(dòng)態(tài)及最終殘留量，以摸清啶酰菌胺在這3種代表性小作物中的殘留特征，并根據(jù)啶酰菌胺在這3種作物中的最終殘留量，進(jìn)行啶酰菌胺的長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為其在小型瓜類、綠葉蔥類、鱗莖蔥類小作物中的安全使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

50%啶酰菌胺水分散粒劑（巴斯夫歐洲公司），啶酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇為色譜純，美國TEDIA公司提供；其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

準(zhǔn)確稱?。?0±0.1）mg啶酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容得1 000.0μg·mL－1啶酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，－20℃保存；用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液初步稀釋，配制0.001、0.005、0.050、0.500、1.000μg·mL－1系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光4℃保存。

1.2 田間試驗(yàn)

參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所制定的《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》和《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》［13，14］，于2019年按照《農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)區(qū)域指南》的要求在全國選取6省份進(jìn)行50%啶酰菌胺水分散粒劑在苦瓜、韭菜、大蒜上的最終殘留試驗(yàn)，設(shè)4個(gè)劑量處理和空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)小區(qū)3個(gè)，每個(gè)小區(qū)面積15 m2。其中兩省同時(shí)進(jìn)行消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)，一個(gè)劑量處理，小區(qū)面積30 m2。正常田間管理，每個(gè)小區(qū)有單獨(dú)的排灌水口，小區(qū)中間設(shè)置隔離帶。

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)：50%啶酰菌胺水分散粒劑有效成分506.25 g·hm－2（最高推薦劑量的1.5倍）均勻噴霧1次，施藥器械為背負(fù)式噴霧器，空白對(duì)照區(qū)噴施純水，施藥后2 h及1、3、5、7、14、21、28 d取樣。

最終殘留試驗(yàn)：50%啶酰菌胺水分散粒劑有效成分337.50 g·hm－2（最高推薦劑量）～506.25 g·hm－2（最高推薦劑量的1.5倍）均勻噴霧2～3次，施藥間隔7 d，最后一次施藥后5、7、10 d分別采集苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹樣品，最后一次施藥后7、14、21 d采集大蒜樣品。

1.3 樣品的制備

用不銹鋼刀具將樣品切成1～2 cm碎塊（段），放在不銹鋼盆中充分混勻，用四分法分取100 g兩份，裝入樣品袋，做好標(biāo)記，放入－20℃低溫冰柜中貯存。

1.4 樣品中啶酰菌胺殘留儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

JMPR（2006年）報(bào)告中指出［15］，－20℃條件下，啶酰菌胺在高含水量作物中24個(gè)月內(nèi)儲(chǔ)藏穩(wěn)定。本試驗(yàn)條件下啶酰菌胺在儲(chǔ)藏期不會(huì)發(fā)生降解，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無影響。

1.5 樣品提取、凈化

稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈（1%乙酸），勻漿2 min，加入2 g氯化鈉，渦旋2 min，靜置10 min，5 000 r·min－1離心5 min。取2 mL上清液轉(zhuǎn)移至裝有0.1 g C18、0.05 g PSA、0.01 g GCB的15 mL離心管中，渦旋2 min，8 000 r·min－1離心5 min，取上清液過0.22μm濾膜，待測(cè)。

1.6 儀器條件

高效液相色譜－質(zhì)譜／質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent 1260－6420（Agilent，USA），配電噴霧ESI離子源；色譜柱Eclipse plus C18，柱長100 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑3.5μm；柱溫35℃；流動(dòng)相乙酸銨水溶液（5 mmol·L－1）∶甲醇＝20∶80；流速0.4 mL·min－1；正離子電離模式；毛細(xì)管電壓4 kV；脫溶劑溫度300℃；脫溶劑氣流量10 L·min－1；霧化器壓力35 kPa；進(jìn)樣量2μL；檢測(cè)方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），具體如表1所示。

表1 啶酰菌胺的MRM條件

1.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

苦瓜空白樣品添加0.004、0.040、1.600 mg·kg－1三檔濃度的啶酰菌胺，韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜空白樣品添加0.004、0.100、5.000 mg·kg－1三檔濃度的啶酰菌胺，每個(gè)加標(biāo)量平行測(cè)定5次，采用1.5中的樣品提取方法和1.6的儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率和變異系數(shù)。

1.8 膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

估算每日攝入量（NEDI）：

風(fēng)險(xiǎn)商（RQ）：

式中：STMRi為規(guī)范殘留試驗(yàn)中值，本研究采用推薦的安全間隔期苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜最終殘留試驗(yàn)數(shù)據(jù)的中值；Fi為我國一般人群對(duì)某一食品的日攝入量，kg·d－1；Ei和Pi分別為食品的可食部分因子和食品加工因子，本文不考慮，均設(shè)為1；ADI為每日允許攝入量，mg·kg－1bw；bw為體重（kg），我國人均體重一般按63 kg計(jì)。當(dāng)RQ＞1時(shí)，表示存在不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，數(shù)值越大，風(fēng)險(xiǎn)越大；RQ＜1時(shí)，表示風(fēng)險(xiǎn)為可接受，數(shù)值越小，風(fēng)險(xiǎn)越?。?6，17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過檢測(cè)苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜基質(zhì)中系列濃度的啶酰菌胺繪制的曲線來評(píng)估方法的線性相關(guān)性。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)作圖，獲得線性回歸方程，在0.001～2.500 mg·L－1范圍內(nèi)啶酰菌胺呈線性關(guān)系（R2＞0.9996），最小檢出量為2×10－12g，最低檢測(cè)濃度為0.004 mg·kg－1?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)見表2。韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜樣品中的基質(zhì)導(dǎo)致啶酰菌胺在儀器上的信號(hào)明顯增強(qiáng)，苦瓜樣品中的基質(zhì)導(dǎo)致啶酰菌胺在儀器上的信號(hào)稍微增強(qiáng)。為了獲得較真實(shí)的殘留試驗(yàn)數(shù)據(jù)，選擇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算田間實(shí)際樣品的濃度。

表2 啶酰菌胺基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)

2.2 方法靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度

試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度及精密度采用添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。采集田間未施過啶酰菌胺的苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜空白樣品進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，苦瓜空白樣品添加0.004、0.040、1.600 mg·kg－1三檔濃度的啶酰菌胺，韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜空白樣品添加0.004、0.100、5.000 mg·kg－1三檔濃度的啶酰菌胺，每個(gè)加標(biāo)量平行測(cè)定5次。啶酰菌胺在苦瓜中的平均添加回收率為91%～96%，RSD為1.3%～3.3%；啶酰菌胺在韭菜中的平均添加回收率為80%～97%，RSD為0.7%～2.6%；啶酰菌胺在大蒜、蒜薹、青蒜中的平均添加回收率為78%～99%，RSD為1.1%～2.8%。

試驗(yàn)方法的靈敏度用最低檢測(cè)濃度（LOQ）來表示。啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜中的最低檢出濃度為0.004 mg·kg－1。表明本方法有較好的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

2.3 啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、青蒜中的殘留消解動(dòng)態(tài)

按照1.5的提取方法和1.6的檢測(cè)方法對(duì)啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、青蒜中的殘留動(dòng)態(tài)樣品進(jìn)行檢測(cè)，其消解規(guī)律均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程式Ct＝C0e－kt。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，啶酰菌胺在苦瓜中的半衰期為3.4～4.5 d，藥后14 d消解率達(dá)84.6%及以上；啶酰菌胺在韭菜中的半衰期為2.9～3.5 d，藥后14 d消解率達(dá)95.4%及以上；啶酰菌胺在青蒜中的半衰期為4.6～6.5 d，藥后14 d消解率達(dá)79.2%及以上。應(yīng)用DPS9.50軟件進(jìn)行差異分析，結(jié)果為啶酰菌胺在3種作物中的消解半衰期差異顯著。

表3 啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、青蒜中的消解動(dòng)力學(xué)方程式及半衰期

2.4 啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜中的最終殘留量

從六地試驗(yàn)結(jié)果（表4）看出，藥后5～10 d，苦瓜中啶酰菌胺殘留量為＜0.004～1.120 mg·kg－1，其中藥后7 d，苦瓜中啶酰菌胺殘留量為＜0.004～0.764 mg·kg－1，殘留中值為0.115 mg·kg－1，殘留最大值為0.764 mg·kg－1。藥后5～10 d，韭菜中啶酰菌胺殘留量為0.338～9.120 mg·kg－1，其中藥后10 d，韭菜中啶酰菌胺殘留量為0.350～4.460 mg·kg－1，殘留中值為1.530 mg·kg－1，殘留最大值為4.460 mg·kg－1。藥后5～10 d，青蒜中啶酰菌胺殘留量為0.348～5.710 mg·kg－1，其中藥后10 d，青蒜中啶酰菌胺殘留量為0.356～3.460 mg·kg－1，殘留中值為1.780 mg·kg－1，殘留最大值為3.460 mg·kg－1。藥后5～10 d，蒜薹中啶酰菌胺殘留量為0.0337～2.970 mg·kg－1，其中藥后7 d，蒜薹中啶酰菌胺殘留量為0.0776～2.020 mg·kg－1，殘留中值為0.540 mg·kg－1，殘留最大值為2.020 mg·kg－1。藥后7～21 d，大蒜中啶酰菌胺殘留量均未檢出（＜0.004 mg·kg－1），其中藥后7 d，大蒜中啶酰菌胺殘留中值、殘留最大值均為0.004 mg·kg－1。對(duì)照區(qū)苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜樣品中啶酰菌胺殘留量均未檢出。

表4 啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜中的殘留量、殘留中值和殘留最大值（mg·kg－1）

2.5 膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

目前啶酰菌胺在我國登記使用作物有16種。GB 2763—2019規(guī)定啶酰菌胺的ADI值為0.04 mg·kg－1bw［18］。根據(jù)表5中啶酰菌胺在登記作物中的平均膳食量及體重調(diào)查數(shù)據(jù)，結(jié)合本試驗(yàn)獲得的推薦間隔期的殘留量中值（表4），以及啶酰菌胺在不同食物中的殘留限量值，通過1.8的方法估算每日攝入量并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)商，得到人群對(duì)啶酰菌胺全膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)概率為24.0%，處于可接受水平。該結(jié)果表明，苦瓜、韭菜、大蒜生產(chǎn)中規(guī)范使用啶酰菌胺不會(huì)對(duì)人群造成慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)。

表5 啶酰菌胺在登記作物中的長期膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

3 討論與結(jié)論

建立了苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜中啶酰菌胺的QuEChERS前處理和高效液相色譜—質(zhì)譜／質(zhì)譜串聯(lián)檢測(cè)方法，最小檢出量為2×10－12g，最低檢測(cè)濃度為0.004 mg·kg－1，空白添加平均回收率為78%～99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～3.3%。該方法操作簡便，準(zhǔn)確度、精密度及檢出限均可滿足啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜上的殘留分析要求。

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明，3種作物之間啶酰菌胺的消解半衰期差異顯著。啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、青蒜中的半衰期分別為3.4～4.5、2.9～3.5、4.6～6.5 d。啶酰菌胺在苦瓜和韭菜中的半衰期無顯著差異，但與其在青蒜中的半衰期差異顯著。啶酰菌胺在作物中的消解速率受其自身結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)影響，還與天氣條件、作物形態(tài)及作物基質(zhì)有關(guān)。啶酰菌胺在青蒜、苦瓜和韭菜中的半衰期差異與在不同作物上的施藥時(shí)間、溫度有關(guān)，啶酰菌胺在青蒜上的施藥時(shí)間在1～3月，氣溫較低，在韭菜和苦瓜上的施藥時(shí)間為7～8月，氣溫較高。啶酰菌胺在這3種小作物中的殘留降解均較快，根據(jù)化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則，屬于易降解農(nóng)藥。

從六地試驗(yàn)結(jié)果可以看出，啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、青蒜、蒜薹、大蒜中的最終殘留量分別低于1.120、9.120、5.710、2.970、0.004 mg·kg－1，韭菜＞青蒜＞蒜薹＞苦瓜＞大蒜，說明啶酰菌胺在作物中的最終殘留量與作物形態(tài)關(guān)系較大，單位質(zhì)量受藥量越大，最終殘留量就越大。同時(shí)，啶酰菌胺在作物中的殘留量和施藥量呈正相關(guān)，與取樣時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，與施藥次數(shù)相關(guān)性較小。

我國尚未制定啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、大蒜上的最大殘留限量。美國規(guī)定啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、大蒜上的最大殘留限量分別為1.6、5.0、5.0 mg·kg－1［20］。建議：50%啶酰菌胺水分散粒劑在苦瓜、韭菜和大蒜上使用時(shí)，最高用藥量337.5 g a.i.·hm－2，最多施藥2次，推薦安全間隔期苦瓜、蒜薹和大蒜7 d，韭菜和青蒜10 d。啶酰菌胺在這些作物上的MRL值可暫定為苦瓜2 mg·kg－1、韭菜10 mg·kg－1、大蒜0.1 mg·kg－1、蒜薹5 mg·kg－1、青蒜7 mg·kg－1。根據(jù)本規(guī)范試驗(yàn)推薦間隔期獲得的殘留量中值，計(jì)算得到人群對(duì)啶酰菌胺全膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)概率為24.0%，處于可接受水平，苦瓜、韭菜、大蒜生產(chǎn)中規(guī)范使用啶酰菌胺不會(huì)對(duì)人群造成慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)?？梢酝茢噜＞吩谛⌒凸项?、綠葉蔥類、鱗莖蔥類小作物中按推薦劑量使用是安全的，其MRL值可以參考本試驗(yàn)推薦啶酰菌胺在苦瓜、韭菜、大蒜上的MRL值。