姜學(xué)東，李文雅

(1.中國人民武裝警察部隊(duì)遼寧省總隊(duì)醫(yī)院 胸外科，遼寧 沈陽 110034；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胸外科，遼寧 沈陽 110001)

肺癌(lung cancer)在全球范圍內(nèi)是常見的惡性腫瘤之一，其中約85%患者為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[1]。人體正常生理功能受機(jī)體細(xì)胞程序性死亡調(diào)節(jié)，細(xì)胞死亡是維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，預(yù)防細(xì)胞癌變的重要過程。近來，新的研究發(fā)現(xiàn)一種非凋亡性細(xì)胞死亡——鐵死亡(ferroptosis)，其特征是脂質(zhì)過氧化物積累至致死水平而引起的膜損傷，是一種不同于凋亡、壞死及自噬的另外一種程序性細(xì)胞死亡形式[2-3]；肺癌組織普遍有著更高的活性氧和脂質(zhì)氧化標(biāo)志物活性氧集團(tuán)(reactive oxygen species, ROS)水平，提示ROS和鐵死亡在肺癌中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-6]。眾多研究證實(shí)，鐵死亡與腫瘤[7]、心腦血管疾病[8]等疾病密切相關(guān)。

愛拉斯汀(erastin/sorafenib)是一種常用的鐵死亡誘導(dǎo)劑，通過抑制谷氨酸/胱氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體xCT的活性，使細(xì)胞中半胱氨酸(cysteine,Cys)和谷胱甘肽(glutathione, GS-H)缺乏，進(jìn)而破壞細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)， ROS堆積，進(jìn)而導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[9]。研究證實(shí)，小分子erastin介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS累積，誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞系N5CP鐵死亡，能有效抑制N5CP生長，提示erastin誘導(dǎo)的鐵死亡對NSCLC的化療有積極作用[6]?，F(xiàn)已明確ROS可以通過引起細(xì)胞損傷，但erastin引起的ROS堆積除了誘導(dǎo)鐵死亡外，是否還可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡尚不明確。本研究就erastin引發(fā)肺癌細(xì)胞A549的損傷和凋亡機(jī)制進(jìn)行探討，確定erastin的抑癌作用，以期為肺癌的治療尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(成都飛鷗爾生物科技有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640和凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK)(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific公司)；Erastin、staurasporine、N -乙?；?L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)、CCK-8試劑盒、annexin V-FITC/PI雙染試劑盒和CFSE/PI雙染試劑盒(Sigma-Aldrich, Merck公司)；鐵(Fe)含量檢測試劑盒(Biovision公司)；ROS活性氧檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞的分組及處理：培養(yǎng)A549細(xì)胞，制備A549細(xì)胞懸浮液，調(diào)節(jié)濃度至1×106細(xì)胞/mL，分為對照組(mock組)和處理組(erastin處理/erastin+Z-VAD-FMK/erastin+NAC)。

1.2.2 CCK-8法分析細(xì)胞活力：將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×106細(xì)胞/mL。將細(xì)胞按5 000個(gè)/孔接種于96孔平板中，貼壁過夜。在每孔中加入不同濃度的erastin (0.1、1、2、4、6、8、10 μmol/L)。處理24 h后，加入CCK-8反應(yīng)液，避光37 ℃下培養(yǎng)4 h。用分光光度計(jì)讀取A450 nm的吸光度值。

1.2.3 鐵(Fe)含量檢測試劑盒檢測鐵含量：用不含EDTA的胰蛋白酶重懸細(xì)胞，收集1×108個(gè)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL，加入0.2 μL Calcein-Am熒光探針，并將細(xì)胞放在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育7 min。孵育結(jié)束后，用Hank’s平衡緩沖液沖洗細(xì)胞3次，并往體系中加入錐蟲藍(lán)(trypan blue)(0.25%終濃度)，室溫孵育1 min以確定細(xì)胞存活率。最后，在488 nm的激發(fā)波長和517 nm 的發(fā)射波長下測量染色熒光信號。

1.2.4 活性氧檢測試劑盒定量分析過氧化物ROS：細(xì)胞與羧基-H2DCFDA共培養(yǎng)30 min，去掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。用X71(U-RFL-T)熒光顯微鏡拍攝綠色熒光信號，并用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.5 流式細(xì)胞測量術(shù)分析細(xì)胞凋亡：用annexin V-FITC/PI雙重染色法對1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色，避光孵育20 min。然后，用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次，加入終濃度1%多聚甲醛PBS并在冰上放置10 min。應(yīng)用3種激光導(dǎo)航流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)定量分析壞死(propidine iodide, PI 陽性)、非凋亡(雙陰性)、早期凋亡(annexin V-FITC陽性和PI陰性)和晚期凋亡細(xì)胞(雙陽性)。

1.2.6 免疫印跡(Western blot)檢測相關(guān)剪切蛋白：用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)對20 μg總蛋白進(jìn)行分離，并將免疫印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(PVDF)上，用含5%牛血清白蛋白的PBS (BSA, Sigma-Aldrich, Merck)封閉。將抗體按1∶1 000比例稀釋，加入到PVDF膜上室溫孵育1 h。用預(yù)冷的T-PBS清洗PVDF膜，然后用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)偶聯(lián)抗兔二抗與PVDF膜室溫孵育30 min。經(jīng)過3次T-PBS清洗后，用X線片曝光。

1.2.7 CFSE/PI雙染色檢測細(xì)胞凋亡：在erastin處理A549細(xì)胞的同時(shí)加入ROS清除劑NAC，共同處理后用CFSE/PI雙染檢測，檢測過程為：將1×106個(gè)細(xì)胞接種于6個(gè)孔板中，并貼壁過夜。加入100 μL CFSE熒光染料, 在37 ℃下培養(yǎng)15 min。去除上清液，用無菌培養(yǎng)基清洗細(xì)胞去除殘留的CFSE。Erastin處理細(xì)胞后，加入5 μg/mL的PI室溫孵育10 min，去除上清液，用無菌培養(yǎng)基清洗細(xì)胞去除殘留的PI。最后，用X71熒光顯微鏡拍攝熒光照片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Erastin誘導(dǎo)A549細(xì)胞損傷

隨著erastin濃度增加，A549細(xì)胞活力降低(圖1A)(P<0.05)；10 μmol/L erastin處理A549細(xì)胞24 h后引起了鐵凋亡的典型表型：鐵離子含量大量升高(圖1B)(P<0.05)，并產(chǎn)生大量過氧化物(圖1C)(P<0.05)；PI染色陽性細(xì)胞(死亡細(xì)胞)比率顯著升高(圖1D)(P<0.05)。

2.2 Erastin誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡

凋亡抑制劑Z-VAD-FMK以不可逆的形式與活化的半胱氨酸蛋白酶caspases結(jié)合，從而阻斷細(xì)胞凋亡。加入Z-VAD-FMK后，erastin引起的A549細(xì)胞凋亡減少(圖2A)；活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)和cleaved-caspase-9表達(dá)量減少(圖2B)。

2.3 Erastin引起ROS增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

Annexin V-FITC/PI雙染顯示，erastin組A549細(xì)胞凋亡率增加，而erastin/NAC組A549凋亡率降低(圖3)。

A.CCK-8 kit was used to detect the inhibitory rate of A549 cells treated with different concentrations of erastin; B.A549 cells were treated with 10 μmol/L erastin for different time (0, 12 and 24 hours) to detect the content of iron, *P<0.05 compared with 0 hour; C.ROS content was analyzed after A549 cells were treated with 10 μmol/L erastin for different time (0, 12 and 24 hours),*P<0.05 compared with 0 hour, #P<0.05 compared with 0 hour; D.the ratio of dead cells was detected by PI staining after A549 cells were treated with 10 μmol/L erastin or 10 μmol/L staurosporine for different time (0 and 12 hours), *P<0.05 compared with mock group; #P<0.05 compared with mock group

N/A.not applicable; A.A549 cells were treated with Z-VAD-FMK and erastin, and cells apoptosis were detected by annexin V-FITC/PI staining; B.Western blot was used to detect the splicing of caspase-9 related proteins in A549 cells after the addition of V-ZAD-FMK and erastin; *P<0.05 compared with mock group; #P<0.05 compared with erastin/Z-VAD-FMK group

A549 cells were treated with NAC and erastin, and cells apoptosis were detected by annexin V-FITC/PI double staining; *P<0.05,△P<0.05 represent comparisons to mock groups, respectively

3 討論

細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞內(nèi)caspase激活和過度氧化有關(guān)[10]。Erastin是典型的鐵死亡誘導(dǎo)劑，通過引起ROS堆積而引起鐵死亡；同時(shí)，ROS通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[11]。ROS、鐵死亡和細(xì)胞凋亡與肺癌的發(fā)病密切相關(guān)，但erastin引起肺癌細(xì)胞死亡的機(jī)制尚未明確。先前的研究表明，用erastin治療抗輻射細(xì)胞A549-R，通過誘導(dǎo)谷胱甘肽過氧化物酶4 (glutathion peroxidase 4, GPX4)介導(dǎo)的鐵蛋白作用，增強(qiáng)了A549-R的輻射敏感性，該研究證實(shí)erastin對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549具有輔助治療作用[12]。本研究通過檢測erastin處理A549細(xì)胞后細(xì)胞活力、鐵離子和ROC含量，證實(shí)erastin可誘導(dǎo)A549細(xì)胞損傷和凋亡。隨后，課題組通過研究凋亡抑制劑Z-VAD-FMK的干預(yù)，在erastin處理A549細(xì)胞后加入Z-VAD-FMK，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡和活化型caspase-9和caspase-3蛋白含量均減少，證實(shí)erastin可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡；為了進(jìn)一步論證erastin引起A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)又加入ROS清除劑N -乙?；?L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)，證實(shí)erastin可使細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。已有研究表明erastin引起ROS積累增加和p53激活，從而誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549鐵死亡和細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果先論證了erastin對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的正向殺傷和誘導(dǎo)凋亡的作用，然后論證其抑制A549作用的機(jī)制是通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生所致，這一結(jié)果與最新的國內(nèi)外研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究證實(shí)erastin通過誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，引起細(xì)胞凋亡，說明erastin對A549的細(xì)胞毒性作用同時(shí)來源于介導(dǎo)了鐵死亡和凋亡過程，并最終達(dá)到抗腫瘤作用。本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡潔、嚴(yán)謹(jǐn)，為肺癌的發(fā)生機(jī)制的闡述提供了新的視角，為肺癌的治療尋找了潛在的靶點(diǎn)。