曾嘉梅，黃 晨

(東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620)

研究表明[1]，在肌腱損傷的患者中，有7%～15%的患者在愈合初期會(huì)出現(xiàn)疤痕愈合、肌腱粘連和關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)受限等并發(fā)癥。在這些患者中，多達(dá)10%的患者需要進(jìn)行二次手術(shù)。漸進(jìn)性愈合的肌腱與周?chē)M織粘連，將導(dǎo)致肌腱功能受損，肌腱損傷治療成本增大。造成肌腱粘連的主要原因是，在肌腱損傷愈合過(guò)程中，成纖維細(xì)胞從周?chē)M織長(zhǎng)入肌腱斷端，同時(shí)肌腱斷端出現(xiàn)炎癥反應(yīng)并機(jī)化[2]。

肌腱的內(nèi)源性愈合和外源性愈合同時(shí)進(jìn)行：內(nèi)源性愈合表現(xiàn)為肌腱細(xì)胞的自我增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的形成；外源性愈合則表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞從周?chē)烨屎突ぶ虚L(zhǎng)入肌腱斷端，生成肉芽，形成瘢痕愈合[3]。肌腱的內(nèi)源性愈合能力比外源性愈合能力弱[4]，這是因?yàn)?，肌腱組織中的血管和神經(jīng)等固有結(jié)構(gòu)少，導(dǎo)致組織代謝活性低、肌腱細(xì)胞的密度低[5]。當(dāng)肌腱受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，外源性愈合會(huì)破壞內(nèi)源性愈合且占據(jù)主導(dǎo)地位。因此，減少外源性愈合，增進(jìn)內(nèi)源性愈合，減輕炎癥，阻止成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，并使肌腱的滑動(dòng)功能恢復(fù)正常，是抑制肌腱粘連的關(guān)鍵。

靜電紡納米纖維膜由于可以模擬腱鞘的微觀結(jié)構(gòu)[6，7]，易于制備和功能化[8]，因此廣泛用作抑制肌腱粘連膜。有研究人員[9，10]以聚乳酸納米纖維膜為物理屏障，把肌腱與周?chē)M織分隔開(kāi)，減少腱周成纖維細(xì)胞的增殖和滲透，阻斷外源性愈合，在抑制肌腱粘連方面取得一定效果。但是巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和聚乳酸降解導(dǎo)致的局部酸性環(huán)境，會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)。陳華等人[11]研究了載布洛芬PLLA納米纖維膜作為抗粘連膜的療效和機(jī)制，發(fā)現(xiàn)相對(duì)不載藥PLLA納米纖維膜，載布洛芬PLLA納米纖維膜能更好地抑制成纖維細(xì)胞黏附及增殖，且體內(nèi)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分和粘連組織評(píng)分更低，說(shuō)明布洛芬可以減少創(chuàng)傷和材料降解導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，并減少血管和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而抑制肌腱粘連。

針對(duì)納米纖維膜拉伸性能差、植入動(dòng)物體內(nèi)后易發(fā)生拉伸斷裂[12]，納米纖維間孔隙較小不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝廢物的排出[13]，將布洛芬直接加入紡絲液中紡絲易造成藥物被聚合物包裹無(wú)法發(fā)揮療效[14]等問(wèn)題，本研究采用動(dòng)態(tài)水浴渦流加捻裝置制備基于納米纖維束集合體的聚乳酸(PLLA)組織工程支架，利用PLLA極佳的吸油性能[15]，通過(guò)動(dòng)態(tài)水浴載入油性藥物布洛芬，高效可控。制備的支架不僅拉伸性能較好、具有大孔結(jié)構(gòu)，而且體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，隨著布洛芬的緩釋?zhuān)∈笈咛コ衫w維細(xì)胞(NIH-3T3)的黏附和增殖被有效抑制，載布洛芬支架具有用于抑制肌腱粘連的可行性。

1 試驗(yàn)部分

1.1 載布洛芬支架的制備

配制濃度為12wt%的PLLA紡絲液，將一定量的PLLA顆粒溶解在體積比為9∶1的DCM/DMSO雙組份溶劑中，隨后在恒溫磁力攪拌器下攪拌24 h，實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖1所示。將配制好的紡絲液注入連接21號(hào)針頭的10 mL注射器中，并安裝到推進(jìn)泵上，設(shè)置擠出速度為1.0 mL/h，紡絲電壓為15 kV，接收滾筒的轉(zhuǎn)速為100 rpm，調(diào)節(jié)針頭到接收水浴表面的距離為10 cm。分別將5 g、10 g的油性藥物布洛芬滴加進(jìn)液體總體積為10 L動(dòng)態(tài)水浴中，在恒溫恒濕(25±2℃，50±5%)的條件下制備不同布洛芬濃度的、基于納米纖維束集合體的PLLA組織工程支架。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)圖

1.2 性能測(cè)試與表征

1.2.1支架的形貌表征

掃描電鏡觀察：對(duì)樣品進(jìn)行噴金處理，利用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)對(duì)纖維的形貌進(jìn)行表征。因?yàn)镻LLA纖維的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較低，在高溫高電壓的情況下纖維形貌會(huì)被破壞，所以?huà)呙桦妷嚎刂圃? kV以下，在樣品的不同區(qū)域拍攝多張SEM圖片。

1.2.2支架的紅外光譜測(cè)試

將試樣裁剪為1 cm×1 cm的正方形，采用紅外光譜儀(FTIR)對(duì)樣品進(jìn)行紅外光譜分析，掃描范圍為500～4000 cm-1。

1.2.3載布洛芬支架抑制肌腱粘連的可行性測(cè)試

1.2.3.1 細(xì)胞的增殖情況檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。在避光的環(huán)境下，將CCK-8儲(chǔ)存液、高糖培養(yǎng)基以1∶9的體積比混合均勻，配制出CCK-8工作液。在細(xì)胞種植到材料上培養(yǎng)1 d、4 d、7 d后，將孔板中的培養(yǎng)基吸出，加入無(wú)菌PBS清洗3次，每孔加入200 μL配好的CCK-8工作液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，每孔吸取100 μL CCK-8工作液于96孔板中，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)得吸光度。

1.2.3.2 細(xì)胞活性測(cè)試

在細(xì)胞種植到材料上培養(yǎng)1 d、4 d、7 d后，從培養(yǎng)箱中取出，將孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗3遍后，每孔加入200 μL配置好的AM/PI活死細(xì)胞染料，避光孵育45 min后，用PBS清洗3遍，隨后立馬將膜置于倒置相差熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞活性。

2 結(jié)果和分析

2.1 支架的形貌表征

不同載藥濃度的聚乳酸組織工程支架的SEM圖如圖2所示，其表觀形式是納米纖維束集合體。聚乳酸多孔纖維沿著纖維束的軸向排列，被動(dòng)態(tài)水浴形成的渦流微弱加捻。纖維束間形成了一定的大孔結(jié)構(gòu)，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送和代謝廢物的排出。纖維上分布大量微細(xì)孔，微細(xì)孔直徑約為200 nm，這樣的納米孔結(jié)構(gòu)可以提高支架的比表面積，有利于PLLA纖維的降解。

圖2 載藥PLLA納米纖維束集合體的SEM圖

2.2 支架的紅外光譜分析

進(jìn)一步通過(guò)FTIR驗(yàn)證載布洛芬聚乳酸支架(PLLA-IBU)成功制備。如圖3所示，布洛芬的圖譜中3432～2955 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)有一個(gè)寬峰，這與布洛芬的羧酸二聚體中O-H的伸縮振動(dòng)有關(guān)；在1708cm-1附近的銳利尖峰，是單羧酸基團(tuán)中C=O伸縮振動(dòng)。對(duì)比PLLA-IBU和PLLA的紅外光譜圖可知，在這些波數(shù)范圍內(nèi)，PLLA-IBU紅外光譜上都出現(xiàn)了布洛芬的特征峰，證明聚乳酸支架上有效負(fù)載了布洛芬。

圖3 布洛芬、PLLA支架和PLLA-IBU支架的紅外光譜圖

2.3 載布洛芬支架抑制肌腱粘連的可行性測(cè)試

2.3.1細(xì)胞增殖能力分析

進(jìn)一步分析細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，圖4是NIH-3T3的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，每組樣品的吸光度值都有不同程度的增加，說(shuō)明細(xì)胞在三種不同布洛芬濃度的支架上都能黏附和增殖。在第1 d，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，這是因?yàn)樵诩?xì)胞的早期培養(yǎng)中，材料的親疏水性是影響細(xì)胞初始黏附的主要因素，而在第7 d，IBU-0組的細(xì)胞增殖數(shù)量顯著高于IBU-0.5組和IBU-1.0組，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，這是由于布洛芬隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)釋放，抑制了NIH-3T3的增殖，降低了NIH-3T3的細(xì)胞活性。

圖4 NIH-3T3在載布洛芬PLLA組織工程支架上的增殖情況

2.3.2細(xì)胞活性分析

如圖5所示，與材料共培養(yǎng)7天中，大部分NIH-3T3能夠存活于IBU-0上，而代表死細(xì)胞的紅點(diǎn)數(shù)目可忽略不計(jì)，這說(shuō)明聚乳酸支架對(duì)這類(lèi)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性。此處需要指出的是，NIH-3T3在IBU-0.5和IBU-1.0上活細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，死細(xì)胞的數(shù)目逐漸增多，說(shuō)明隨布洛芬含量的增加，NIH-3T3細(xì)胞的活性受到抑制。

圖5 NIH-3T3在載藥聚乳酸支架上培養(yǎng)的活、死細(xì)胞染色圖

3 結(jié)語(yǔ)

在本研究中，利用實(shí)驗(yàn)室自組裝的動(dòng)態(tài)水浴渦流加捻裝置，通過(guò)靜電紡絲技術(shù)，一步制備了負(fù)載油性藥物布洛芬，且同時(shí)具備納米和微米孔隙結(jié)構(gòu)的組織工程支架。通過(guò)一系列手段表征支架性能，得到的主要研究結(jié)論如下：

(1)納米纖維束集合體中，纖維呈高度取向結(jié)構(gòu)，可以提高纖維取向方向的拉伸強(qiáng)度；纖維束有一定的捻度，可以增強(qiáng)纖維間的抱合力，進(jìn)一步增強(qiáng)支架的拉伸強(qiáng)度。同時(shí)，取向結(jié)構(gòu)的納米纖維，可以仿生肌腱組織結(jié)構(gòu)。

(2)聚乳酸纖維具有較好的吸油性能，可以有效地吸附油性藥物布洛芬，從而實(shí)現(xiàn)支架上藥物的負(fù)載。

(3)納米纖維束集合體具有微米尺度的纖維束所形成的大孔結(jié)構(gòu)，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送和代謝廢物的排出；納米尺度的纖維上形成的納米孔結(jié)構(gòu)，有利于藥物的負(fù)載和緩釋。

(4)將NIH-3T3種植在不同載藥濃度的、基于納米纖維束集合體的PLLA組織工程支架上進(jìn)行細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)分析。發(fā)現(xiàn)NIH-3T3可以在不同布洛芬濃度的支架上黏附和增殖。但I(xiàn)BU-0、IBU-0.5和IBU-1.0上NIH-3T3的增殖被抑制，細(xì)胞活性依次降低。說(shuō)明載布洛芬聚乳酸支架可以減少NIH-3T3的增殖和滲透，有望在肌腱損傷模型中表現(xiàn)出優(yōu)良的抑制粘連功能。