宋曉賀, 李彥凱，宋亞玲, 鄭彥坤, 侯振林，于道平

(安慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，水生生物保護與水生態(tài)修復(fù)安徽省高等學(xué)校工程技術(shù)研究中心,安徽 安慶 246133)

蚯蚓糞是蚯蚓對其生活周圍環(huán)境的有機物進行利用和降解的產(chǎn)物，是一種含有多孔團粒狀結(jié)構(gòu)的細碎類物質(zhì)，含有豐富的放線菌、細菌、真菌、植物生長激素和酶類物質(zhì)等，具有形狀均一、表面積大和持水能力強等特點，在生菜、玉米等作物育苗及生長上表現(xiàn)出良好效果，可用于緩解番茄、黃瓜、西瓜等經(jīng)濟作物連作障礙和土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)修復(fù).

土傳病害是指主要發(fā)生在植物根部且病原菌通過土壤傳播而引起的病害.土傳病害由于病原菌可在土壤中存活數(shù)年且具有隱蔽性，其防治往往非常困難.蚯蚓糞中含有大量有益微生物，且不存在在土壤中存活定殖難的問題.因此，蚯蚓糞在土傳病害防控中具有很大的應(yīng)用潛力.Szczech在生長介質(zhì)中加入蚯蚓糞后，西紅柿根腐病受到了抑制.胡艷霞等從蚯蚓糞中分離獲得2株拮抗微生物菌球——孢鏈霉菌(

Streptomyces

globisporus

)和丁香苷鏈霉菌(

S.

syringini

)，對黃瓜苗期立枯病和枯萎病具有顯著抑制作用.Gopalakrishnan等從蚯蚓糞中分離獲得5株對鐮刀菌有拮抗作用的細菌，它們能夠有效防控鷹嘴豆枯萎病.王勝等將蚯蚓糞作為底肥，有效地控制了油菜根腫病的發(fā)生與危害.為檢驗蚯蚓有機肥對銅陵白姜生長特性、產(chǎn)量及對姜瘟病抑制效果的影響，筆者團隊連續(xù)3年進行田間生長測試和姜瘟病發(fā)生機制研究，結(jié)果顯示，施用蚯蚓肥的銅陵白姜，長勢良好，莖粗壯，肉質(zhì)肥厚，產(chǎn)量增加，姜瘟病的發(fā)病率降低.研究表明，蚯蚓糞作為生物防治成分能在一定程度上抑制土傳病害的發(fā)生，蚯蚓糞中有益微生物在調(diào)控土傳病害中發(fā)揮重要作用.

高通量測序技術(shù)具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低運行成本的特點，能夠深入、細致地研究微生物群落結(jié)構(gòu)，已被廣泛應(yīng)用于多種生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性研究.然而，關(guān)于蚯蚓糞中微生物的群落結(jié)構(gòu)鮮有報道.該文利用ITS和16S rRNA高通量測序技術(shù)檢測蚯蚓糞中真菌和細菌群落的種類和數(shù)量，為進一步開發(fā)利用蚯蚓糞中微生物資源、探索其在植物土傳病害生物防治方面的作用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蚯蚓糞取自合肥誠匯生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司.蚯蚓品種為赤子愛勝蚓(

Essential

fetide

).在常溫下使用牛糞飼養(yǎng)蚯蚓20 d后挑選剛產(chǎn)生的尚未干燥、顏色為黑色、大小均勻的新鮮蚯蚓糞便，用鑷子輕輕夾入無菌的保鮮袋中，6次重復(fù)，4 ℃冷藏運送至實驗室，放入-80 ℃冰柜保存?zhèn)溆?

1.2 基因組DNA的提取

參照Omega Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書，將6組蚯蚓糞充分混合均勻，提取蚯蚓糞宏基因組DNA.用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性.

1.3 蚯蚓糞細菌16S rRNA和真菌ITS高通量測序

PCR擴增及高通量測序采用的細菌引物為帶Barcode 的16S rRNA 基因V3-V4通用引物341F：5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3和805R：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′.真菌引物為帶Barcode的ITS1-2通用引物ITS1F：5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3′和ITS2R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC3′.PCR反應(yīng)體系為：2×Taq master Mix 15 μL、正反向引物(10 μmol·L)各1 μL、Genomic DNA (1 ng·μL)10 μL(5～10 ng)，補水至總體積30 μL.PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；5個循環(huán)(94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s)；20個循環(huán)(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 10 min.4 ℃保存.各樣本重復(fù)3次，同一樣本PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物.利用NOVA PE250進行16S rRNA高通量測序，Miseq 2x 300 bp進行ITS高通量測序，委托生物工程(上海)股份有限公司完成.對原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，根據(jù)97%的相似度對序列進行OUT聚類，選取高質(zhì)量的序列進行分析.

1.4 數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析

對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，根據(jù)接頭Barcode序列拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列.之后去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù).利用Uparse軟件對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類，在97%序列相似度水平上計算OTU的數(shù)量.利用Qiime軟件計算Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、Simpson指數(shù)、Goods-coverage指數(shù)和ACE指數(shù).采用RDPclassifier軟件將前述各樣品合格序列進行物種分類操作，閾值設(shè)置為0.8，低于該閾值的分類結(jié)果被劃歸為unclassified一類，統(tǒng)計樣本物種門、綱、目、科、屬、種的群落組成.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序結(jié)果及微生物群落多樣性分析

蚯蚓糞樣品的數(shù)據(jù)和OTUs數(shù)目統(tǒng)計見表1.供試樣本測序共產(chǎn)生249 653條原始序列，質(zhì)控后得到249 364條高質(zhì)量的目標(biāo)片段.207 331序列用于構(gòu)建OTUs并且獲得注釋信息.在97%的序列一致性水平上，共獲得注釋信息的序列聚類成11 951 OTUs，細菌和真菌含有的OTUs數(shù)目分別為：10 218和1 733.

表1 蚯蚓糞高通量測序注釋結(jié)果統(tǒng)計和Alpha多樣性指數(shù)

蚯蚓糞微生物群落的豐富度和多樣性評估可用Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、ACE指數(shù)和覆蓋率.

由表1可知，文庫覆蓋率接近1，說明測序數(shù)據(jù)量能夠真實地反應(yīng)樣品細菌和真菌的多樣性.蚯蚓糞細菌Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和ACE指數(shù)均顯著高于真菌的，說明蚯蚓糞中細菌群落不僅豐度最大，而且物種的數(shù)量也最多.

2.2 蚯蚓糞細菌菌群結(jié)構(gòu)特征

細菌群落共檢測到34個菌門，其中序列占比在0.01%及以上細菌菌門有28個，相對豐度最大的優(yōu)勢菌門為變性菌門Proteobacteria，占39.55%，其次為擬桿菌門Bacteroidetes(13.37%)、酸桿菌門Acidobacteria(9.79%)、放線菌門Actinobacteria(9.36%)、浮霉菌門Planctomycetes(9.02%)(圖1(a)).在目的水平上共檢測到123個類群，其中豐度大于5%的有3個，分別為浮霉?fàn)罹縋lanctomycetales、根瘤菌目Rhizobiales、噬纖維菌目Cytophagales(圖1(b)).未分類和未知類群共占37.26%.在屬的水平上，共有693個類群被分類到，其中平均豐度大于1%的有Gp6、

Ohtaekwangia

、纖維素降解菌

Chryseolinea

、

Demequina

、芽單胞菌屬

Gemmatimonas

、

Phaeodactylibacter

、

Aridibacter

、黃桿菌屬

Flavobacterium

等12個，未分類和未知類群共占70.89%.

圖1 在門(a)和目(b)水平上蚯蚓糞細菌群落相對豐度

2.3 蚯蚓糞真菌菌群結(jié)構(gòu)特征

真菌群落高通量測序共檢測到9個門(圖2(a)).羅茲菌門Rozellomycota和子囊菌門Ascomycota為優(yōu)勢門，分別占31.55%和24.38%.在目的水平上，豐度在0.01%及以上者有26個，優(yōu)勢目為糞殼菌目Sordariales，占12.67%，其次為Togniniales 和小子囊菌目Microascales，分別占3.59%和3.48%(圖2(b)).羅茲菌門真菌未鑒定到目.未知分類占32.4%.在屬種的水平上，共檢測到243個屬147種，其中平均豐度大于0.05%的屬有16個，分別為尾柄孢殼屬

Cercophora

(6.61%)、

Phaeoacremonium

(3.59%)、柄孢殼菌

Podospora

(1.07%)、孢殼屬

Zopfiella

(1.19%)、熱鏈球菌屬

Mycothermus

(0.05%)、紅光樹屬

Kemia

(0.24%)、絲孢菌屬

Scedosporium

(0.09%)、鐮刀菌屬

Fusarium

(0.42%)、枝頂孢屬

Acremomium

(0.12%)、

Plectosphaerella

(0.12%)、曲霉菌屬

Aspergillus

(0.61%)、嗜熱真菌屬

Thermomyces

(0.09%)、莖點霉屬

Phoma

(0.07%)、念珠菌屬

Candida

(0.06%)、被孢霉菌

Mortierella

(0.55%)、鬼傘屬

Coprinellus

(0.1%).

圖2 在門(a)和目(b)水平上蚯蚓糞真菌群落相對豐度圖

3 討 論

蚯蚓糞自身含有大量有益微生物，有促進土壤微生物生長以及酶活性提高的作用.筆者的研究首次利用16S rRNA 和ITS高通量測序技術(shù)，系統(tǒng)分析蚯蚓糞中細菌和真菌群落的特征.研究中檢測到大量的微生物，在細菌群落中，91%的OTUs被注釋到門的分類單元，67%的OTUs被注釋到科的分類單元，49%的OTUs被注釋到屬的分類單元.在真菌群落中，有32%的OTUs被注釋到門的分類單元，20%的OTUs被注釋到科的分類單元，16%的OTUs被注釋到屬的水平.究其原因，蚯蚓糞中存在很大比例的未知分類地位和未知功能的微生物，這些微生物可能是目前還不能進行人工培養(yǎng)的微生物，這些不可培養(yǎng)微生物還未被廣泛認(rèn)識.另外，利用傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)法分離到一些細菌和真菌屬，在高通量測序中可能并無顯示或者豐度很低，這可能是由于一些微生物多以孢子的形式存在，而在總DNA提取過程中對其裂解不充分導(dǎo)致.即使如此，通過結(jié)果可看出利用16S rRNA和ITS高通量測序技術(shù)研究蚯蚓糞微生物組在測序數(shù)目和注釋分析上都是可行的.

蚯蚓糞是一種優(yōu)質(zhì)、安全的天然有機肥料，對土壤環(huán)境質(zhì)量和作物生長具有明顯的改善和促進作用，在土傳病害防控中具有很大的應(yīng)用潛力.筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓糞對銅陵白姜具有的促生作用和對姜瘟病的抑制作用，推測是蚯蚓糞中有益微生物發(fā)揮的重要作用.筆者的研究目的是嘗試?yán)梦⑸锝M的新技術(shù)挖掘和尋找蚯蚓糞中有益微生物資源，揭示蚯蚓糞抑制姜瘟病發(fā)生的作用機理.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在蚯蚓糞中存在大量可以用來防治植物病害的微生物.在真菌群落中，檢測到大量的有益生防真菌，比如肉座菌目Hypocreales中的木霉屬

Trichoderma

、綠僵菌屬

Metarhizium

、粘帚霉屬

Gliocladium

，這些屬的真菌廣泛分布于土壤中，是非常重要的植物寄生真菌、昆蟲寄生真菌和植物共生真菌.而糞殼菌目Sebacinales中的毛殼菌屬

Chaetomium

中大多數(shù)種產(chǎn)生活性強的纖維素酶，能有效降解纖維素和有機質(zhì)，并對土壤中的其他微生物產(chǎn)生拮抗作用.同時檢測到Saccharomycetales、Tremellales、Sporidiobolales和Filobasidiales 4個目中5個屬酵母菌的存在，即念珠菌屬

Candida

、隱球菌屬

Cryptococcus

、線黑粉酵母屬

Filobasidium

、擲孢酵母屬

Sporobolomyces

、畢赤酵母屬

Pichia

，這些屬的酵母菌中均存在可以用來控制植物病害的生防菌.此外，還檢測到5個屬銹菌的重寄生菌和1個屬的白粉寄生孢，分別是支頂孢屬

Acremonium

、單端孢屬

Trichothecium

、柱隔孢屬

Ramularia

、鏈格孢屬

Alternaria

、鐮刀菌屬

Fusarium

和白粉寄生孢

Ampelomyces

quisqualis

，是銹菌和白粉菌上常見和重要的重寄生菌.在蚯蚓糞細菌群落中共檢測到693個屬的存在，有一些是可以用來防治植物病害的生防細菌.厚壁菌門Firmicutes的芽孢桿菌屬

Bacillus

，擬桿菌門Bacteroidetes的假單胞菌屬

Pseudomonas

、黃桿菌屬

Flavobacterium

和短桿菌屬

Brevibacterium

，變形菌門Proteobacteria的

Stenotrophomonas

、假黃色單胞菌屬

Pseudoxanthomonas

、沙雷氏菌屬

Serratia

和

Brevundimonas

，這些屬的細菌是土壤和植物根際微生物的優(yōu)勢種群，也是常見的植物內(nèi)生細菌，不僅可以防治植物病害，還能增加產(chǎn)量.此外，還檢測到具有生防潛力的放線菌門的鏈霉菌屬

Streptomyces

、小單孢菌屬

Micromonospora

、放線菌屬

Actinomyces

、游動放線菌屬A

ctinoplanes

、馬拉杜放線菌屬

Actinomadura

，其中鏈霉菌屬豐度最高.這些微生物的存在，為植物土傳病害和土壤改良提供新的思路和資源，為進一步研究蚯蚓糞生態(tài)學(xué)功能提供有益的指導(dǎo)和理論基礎(chǔ)研究.