蔡龍?jiān)?林宗漢

【摘要】骨性關(guān)節(jié)炎是一種關(guān)節(jié)退行性疾病，隨著人口老齡化問題的加重，該疾病的發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，成為全球醫(yī)學(xué)界普遍面臨的醫(yī)療難題。間充質(zhì)干細(xì)胞的來源的細(xì)胞外囊泡是目前關(guān)于骨關(guān)節(jié)炎治療的一項(xiàng)新型研究。本文對(duì)細(xì)胞外囊泡的的生物學(xué)特點(diǎn)、作用機(jī)制、增強(qiáng)其作用效果的預(yù)處理策略及干細(xì)胞來源和特性等方面的研究進(jìn)展作一總結(jié)，論述其未來運(yùn)用的可能性。

【關(guān)鍵詞】骨關(guān)節(jié)炎;間充質(zhì)干細(xì)胞;細(xì)胞外囊泡;綜述

【中圖分類號(hào)】R684.3 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? 【文章編號(hào)】2026-5328（2021）01-113-05

1.前言：

骨性關(guān)節(jié)炎（OA） 是一種涉及整個(gè)關(guān)節(jié)的慢性退行性疾病，其主要病理改變是關(guān)節(jié)滑膜炎癥，軟骨退化、缺損，軟骨下骨再生及骨贅形成。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病基于關(guān)節(jié)組織的損傷和修復(fù)之間復(fù)雜生理關(guān)系的失衡，而不是一種簡(jiǎn)單的機(jī)械性改變。近些年來，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）被越來越多地運(yùn)用到骨關(guān)節(jié)炎的治療研究中。而細(xì)胞外囊泡作為MSC旁分泌作用的重要載體包含親代細(xì)胞的關(guān)鍵表面標(biāo)志物和信號(hào)分子并且具有類似的抗炎和營(yíng)養(yǎng)特性，能起到和MSC同樣的治療作用，因此基于 MSC旁分泌作用的去細(xì)胞研究逐漸成為OA治療的新領(lǐng)域。

2.細(xì)胞外囊泡概述：

細(xì)胞外囊泡（EV）是指從細(xì)胞膜上脫落或者由細(xì)胞分泌的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡小體，根據(jù)其大小和釋放方式可以大致分為3種類型：外泌體（直徑30～100nm）、微囊泡（直徑100～1000nm）和凋亡小體（直徑50～4000nm）。外泌體起源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中;而微囊泡是由細(xì)胞膜的向外出芽產(chǎn)生。它們攜帶的多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA、mRNA、miRNA等反映了親代細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)，通過受體-配體相互作用，直接膜融合和內(nèi)吞作用等三種方式作為信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物在細(xì)胞間發(fā)揮作用，介導(dǎo)靶細(xì)胞活化[1]。與MSC相比EV自身不具有增殖特性，同時(shí)易于生產(chǎn)、保存和轉(zhuǎn)移、靜脈注射更加安全、免疫原性更低，因此更適合作為疾病治療的工具。

3. EV在OA治療中的作用

3.1 EV減輕OA炎癥反應(yīng)

炎癥是貫穿OA過程始終的最主要的病理變化，目前普遍認(rèn)為IL-1β、TNF-α和IL-6在OA病理變化中起主要作用，而NF-κB信號(hào)通路作為細(xì)胞炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的關(guān)鍵通路，通過介導(dǎo)以上炎癥因子的產(chǎn)生也在OA進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。

已經(jīng)觀察到MSC來源的EV可以下調(diào)TNF-α、IL-6、NF-κB和IFN-γ的mRNA表達(dá)[2]，這表明EV可以通過直接抑制炎癥因子的表達(dá)以及干預(yù)NF-κB信號(hào)通路來減輕炎癥。EV分泌的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）通過阻止激活的p65NF-κB與RANTES啟動(dòng)子中的κB元素結(jié)合從而阻止trans激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄，阻斷NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)[3];TGFBI也可以通過穩(wěn)定NF-κB抑制劑IκBα，負(fù)調(diào)控Toll樣受體等減少NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)[4][5]。此外，NF-κB作為TLR信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄因子之一也受TLR信號(hào)的激活，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA（miR-146a、miR-146b、miR-497、miR-106a、miR-20b、miR-21等）通過作用于TLR-NF-κB途徑上的不同位點(diǎn)如MyD88、IRAK1、TRAF6、IRAK4等來負(fù)調(diào)控該信號(hào)的激活[6]。由此可知EV對(duì)OA炎癥的抑制可以通過其旁分泌作用中的多種細(xì)胞因子及miRNA對(duì)NF-κB信號(hào)通路的干預(yù)來實(shí)現(xiàn)。

3.2 EV對(duì)OA的免疫調(diào)節(jié)作用

目前研究認(rèn)為軟骨組織的損傷或老化所形成的組織微碎片以及年齡、肥胖等因素均可能誘發(fā)關(guān)節(jié)內(nèi)的自身免疫過程，這一過程主要由滑膜組織中多種免疫細(xì)胞、補(bǔ)體系統(tǒng)等介導(dǎo)，激活一系列炎癥信號(hào)通路，引起炎癥因子及組織蛋白酶的釋放，加重軟骨損傷[7]。其中巨噬細(xì)胞在該過程中起主要作用，尤其是經(jīng)典型巨噬細(xì)胞（M1），通過產(chǎn)生各種促炎細(xì)胞因子加劇滑膜炎癥，同時(shí)可以激活滑膜成纖維細(xì)胞釋放MMPs。相反替代性活化巨噬細(xì)胞（M2）則被認(rèn)為具有抗炎和組織修復(fù)特性。此外，樹突狀細(xì)胞（DC）、T細(xì)胞、B細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞（NK）等也不同程度參與關(guān)節(jié)內(nèi)免疫反應(yīng)，而現(xiàn)有的研究表明EV對(duì)上述免疫細(xì)胞均有不同程度的抑制作用[8]。

MSC衍生的EV內(nèi)含有多種免疫調(diào)節(jié)因子，如TGF-β、HGF、IDO-1、IL-1O、IL-1RA等，這些因子抑制并減輕NK細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性;減少輔助型T細(xì)胞Th1和Th17的產(chǎn)生并且抑制Th1和Th17細(xì)胞中免疫抑制Treg的轉(zhuǎn)化;抑制IL-1和IL-1R的結(jié)合;調(diào)節(jié)TNF-α的局部濃度，減少NFκB的激活[9]。尤其是對(duì)OA中巨噬細(xì)胞的作用調(diào)節(jié)已在大量的研究中證明，IL-10、PGE2和IDO等可溶性因子等通過不同的方式促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化同時(shí)進(jìn)一步影響其他免疫細(xì)胞的增殖、分化，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)[10];另外，EV中的多種miRNA也參與巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)，如：miR-146、miR-216a-5p、miR-27a-3p、let-7b、miR-182等[11] ?？傊珽V通過上述免疫調(diào)節(jié)作用有利于減緩OA進(jìn)程，促進(jìn)組織修復(fù);同時(shí)這種自身免疫調(diào)節(jié)一定程度上也解釋了其在進(jìn)入人體后的相對(duì)安全性，因?yàn)榈侥壳盀橹股形从腥梭w和動(dòng)物試驗(yàn)中EV植入后明顯免疫反應(yīng)的報(bào)道。

3.3 EV對(duì)軟骨降解酶的抑制作用

我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類關(guān)節(jié)透明軟骨由95%的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和僅5%的稀疏分布的軟骨細(xì)胞組成，而細(xì)胞外基質(zhì)則主要由II型膠原蛋白和蛋白聚糖組成。從OA的長(zhǎng)期病理進(jìn)程來看，早期以膠原蛋白的降解為主，后期則是蛋白聚糖的降解。MMPs和ADMATs是兩類在OA軟骨退化中其主要作用的降解酶，分別負(fù)責(zé)上述II型膠原蛋白和蛋白聚糖的降解。

NF-κB可以直接或間接誘導(dǎo)基質(zhì)降解酶和其他OA相關(guān)因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致異常的軟骨分解代謝途徑。 NF-κB通過位于MMP1、MMP9和ADAMTS5基因啟動(dòng)子中的NF-κB反應(yīng)元件誘導(dǎo)分解代謝基因的表達(dá)，并促進(jìn)OA主要促炎和破壞性介質(zhì)的表達(dá)，包括COX2、PGE2和INOS。此外NF-κB信號(hào)的激活可以上調(diào)ELK1和ELF3、HIF-2α等轉(zhuǎn)錄因子而誘導(dǎo)上述降解酶類表達(dá)。如活化的HIF-2α通過與位于分解基因啟動(dòng)子中的HIF-2α結(jié)合基序結(jié)合，促進(jìn)基質(zhì)降解酶的表達(dá);此外，HIF2α的靶基因CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ）也可通過直接誘導(dǎo)MMP13的表達(dá)而加重OA的進(jìn)展[12]。通過對(duì)NF-κB信號(hào)通路與基質(zhì)降解酶關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合前面論述表明EV通過對(duì)多種炎癥因子及NF-κB信號(hào)通路的抑制而減少M(fèi)MPs和ADAMTs的表達(dá)。此外，EV直接分泌的TIMP3可緊密結(jié)合與細(xì)胞外基質(zhì)中，抑制多種MMPs對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解[13];PAI-1作為兩種纖溶酶原激活物uPA和tPA的主要生理抑制劑，也能抑制纖溶酶依賴性MMPs的激活，因而一定程度上減少M(fèi)MPs對(duì)ECM蛋白的降解[14]。

3.4 EV對(duì)軟骨組織的營(yíng)養(yǎng)修復(fù)作用

除了以上敘述的抗炎和降解酶抑制作用外，EV也分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞增殖并觸發(fā)內(nèi)源性軟骨修復(fù)分子的形成。TGF-β、IGF-1等可以刺激蛋白聚糖、COL2A1、COMP、HA等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的產(chǎn)生，同時(shí)減輕OA炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大，從而在軟骨細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[15][16]。bFGF本身則是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中較為豐富的一種細(xì)胞因子，通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合而激活合成代謝途徑，抑制聚集蛋白聚糖酶的活性[17]。骨形態(tài)生發(fā)蛋白（BMPs）作為TGF-β家族成員之一，同樣可以由EV分泌，其中BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP7、BMP9等均對(duì)軟骨的形成和修復(fù)具有促進(jìn)作用[17]?？傊?，EV通過將多種蛋白因子傳遞到關(guān)節(jié)軟骨損傷部位，發(fā)揮其抗炎及營(yíng)養(yǎng)作用促進(jìn)軟骨組織的修復(fù)。

4.EV治療作用改善的策略

一些針對(duì)ASC的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)炎性條件下的預(yù)處理能夠在一定程度上增強(qiáng)EV的免疫調(diào)節(jié)作用，并且目前認(rèn)為該作用機(jī)制至少部分歸因于EV中部分miRNA（miR-34a-5p、miR-146a-5p、miR-21-5p）表達(dá)的上調(diào)以及這些miRNA介導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞向M2型的極化[18]。缺氧預(yù)處理也是目前運(yùn)用較多的方式，劉宏斌等的一項(xiàng)研究表明低氧條件下培養(yǎng)的ASC分泌更多的EV，并且引起一系列特殊的miRNAs的表達(dá)改變，尤其是和親代MSC相比差異化表達(dá)的miRNAs優(yōu)先調(diào)控機(jī)體細(xì)胞的黏附、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)運(yùn)和凋亡等生物學(xué)功能，提示其在組織損傷和修復(fù)中的重要作用[19]。

通過使EV中某些作用機(jī)制明確的miRNA的過表達(dá)來增強(qiáng)治療作用的嘗試也在不同類型的MSC中開展。如彭凱等采用慢病毒轉(zhuǎn)染法將用miR-140-5p轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（huc-MSC），結(jié)果表明過表達(dá)miR-140-5p的huc-MSC通過抑制NLRP3、caspase-1、MMP-13和ADAMTs-5的表達(dá)從而顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨退變并顯著提高軟骨修復(fù)能力[20]。Mao等采用miR-92a-3p轉(zhuǎn)染人BMSC，使其在BMSC外泌體中高表達(dá)，通過miR-92a-3p對(duì)wnt5A直接的靶向抑制作用促進(jìn)軟骨基質(zhì)蛋白，COL2A1和COMP的表達(dá)，抑制MMP13的表達(dá)[21]。以上研究為將來EV用于臨床治療提供了進(jìn)一步的研究方向，通過人為的方式干預(yù)EV的作用機(jī)制，使其產(chǎn)生更好的治療效果。

5.EV的不同來源及特點(diǎn)

EV的來源廣泛，幾乎可以由所有類型細(xì)胞產(chǎn)生，盡管目前較為一致地認(rèn)為MSC是用于產(chǎn)生EV的最佳細(xì)胞源，但是來源于骨髓、脂肪組織、臍帶、滑膜、沃頓氏膠樣組織、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（iPSC）等組織細(xì)胞的EV在內(nèi)容物組成及功能療效等方面也存在差異。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）目前被認(rèn)為是MSC治療領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BMSC-EV能夠重新誘導(dǎo)成熟關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，同時(shí)減少分解代謝標(biāo)記物和炎癥標(biāo)記物的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞活化，誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞表型的產(chǎn)生，從而保護(hù)軟骨細(xì)胞免于誘導(dǎo)凋亡[22]。但是其在獲取上的較高侵入性、相對(duì)較低的增殖潛力以及供體年齡在細(xì)胞存活、增殖和分化潛能方面的影響，似乎提示其難以成為最理想的細(xì)胞源[23]。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ASC）和BMSC來源的EV似乎表現(xiàn)出相似的治療作用，但ASC-EV的優(yōu)勢(shì)在于其獲取方式上侵入性更小，也更易獲得，有研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中有核細(xì)胞的1–10%是ASC，而骨髓中BMSC的占比只有0.0001–0.01%[24];其次，ASC本身具有更高的分化潛力以及更長(zhǎng)久的離體擴(kuò)增能力，能夠耐受缺血、缺氧的軟骨微環(huán)境引起的細(xì)胞凋亡，從而表現(xiàn)出更優(yōu)越的治療效果[22]。然而，有限的研究發(fā)現(xiàn)，不同類型和不同部位的脂肪組織在MSC含量和分化能力上存在差異，而目前來講最佳的獲取部位還需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)[25]。

胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞（ESC-MSC）具有比其他類型MSC更高的自我增殖能力、多項(xiàng)分化能力及更好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性，而源于該類MSC的EV則保留了親代細(xì)胞的某些優(yōu)勢(shì)[26]。Wang等的研究同樣在動(dòng)物模型中證明ESC-MSC外泌體可以通過平衡細(xì)胞外基質(zhì)中II型膠原蛋白的合成與基質(zhì)降解酶的表達(dá)阻止OA病變進(jìn)展[27]。并且有研究觀察到由ESC-MSC-EV治療的軟骨缺損表現(xiàn)出形態(tài)良好的透明軟骨生成，與周圍原有的軟骨組織可以完全結(jié)合[28]。但是，倫理學(xué)上的爭(zhēng)議限制了該類型MSC的廣泛研究。

誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（iPSC）則可以由成人或患者自身的各種體細(xì)胞經(jīng)iPS技術(shù)誘導(dǎo)形成，避開了胚胎干細(xì)胞的倫理限制，這使得iMSC可以更微創(chuàng)的方式獲取，不受來源數(shù)量的限制[29]。并且iMSC在細(xì)胞增殖，免疫調(diào)節(jié)，細(xì)胞因子譜，調(diào)節(jié)外泌體的產(chǎn)生以及旁分泌因子的分泌方面更具優(yōu)勢(shì)[30]。Greca等的研究表明和iPSC衍生的EV相比，iMSC分泌的EV富含細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞基質(zhì)粘附、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白，表明其具有更強(qiáng)的組織修復(fù)能力[31]。Zhu等比較了來自iMSCs和SMMSCs的外泌體對(duì)OA的治療作用，在小鼠膠原酶誘導(dǎo)的OA模型中，iMSC或SMMSC外泌體的關(guān)節(jié)內(nèi)注射均可減輕OA，刺激軟骨細(xì)胞遷移和增殖，但相比之下iMSC-Exos表現(xiàn)出更顯著的治療效果[32]。

6小結(jié)

目前為止，對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的系統(tǒng)回顧已經(jīng)證明MSC-EVs在促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞遷移和增殖，促進(jìn)ECM合成，抗分解代謝以及抗炎和免疫調(diào)節(jié)方面的積極作用。從目前的研究進(jìn)程來看，EV作為一種細(xì)胞間通訊媒介，其中的miRNA和豐富的旁分泌因子起主要作用，但是尚沒有一個(gè)相對(duì)完整的作用譜系被表征出來。不同來源的EV缺乏在生物學(xué)特性及治療效果等方面的系統(tǒng)對(duì)比，因此尚無法基于綜合優(yōu)勢(shì)選擇出最佳的EV來源。對(duì)EV以某些方式進(jìn)行預(yù)處理確實(shí)可以不同程度地增強(qiáng)EV的治療作用，但是目前這方面的研究只是提供了一些方向，由于各種研究在試驗(yàn)方法及療效標(biāo)準(zhǔn)方面多有不同，因此較難形成統(tǒng)一的證據(jù)?？傊?，目前的研究初步明確了EV在用于治療骨關(guān)節(jié)炎的前景，但是我們還缺乏對(duì)其內(nèi)容物的詳盡了解，尚無法建立起完整的作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)來闡明其臨床療效與安全性，這需要我們更多進(jìn)一步的的研究。

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作者簡(jiǎn)介：蔡龍?jiān)疲?993.12，男，漢族，江西會(huì)昌人，碩士研究生，研究方向：骨與關(guān)節(jié)損傷與骨病研究。

通信作者：林宗漢 Email：LZH1965555@163.com