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        山楂多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

        2021-09-10 07:22:44張全才田文妮羅志鋒陳海平黎攀杜冰李德靈
        中國食物與營養(yǎng) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:提取抗氧化

        張全才 田文妮 羅志鋒 陳海平 黎攀 杜冰 李德靈

        摘 要:目的:優(yōu)化熱水浸提法提取山楂多糖的最佳工藝條件,并研究其結(jié)構(gòu)和體外抗氧化活性。方法:在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以水浴溫度、水浴時間、料水比、冷浸時間為因素,通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化其提取工藝;多糖經(jīng)純化后分別采用GPC、GC-MS分析其分子量和單糖組成,并通過對超氧自由、羥自由基、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除試驗測定山楂多糖的抗氧化活性。結(jié)果:最佳提取條件為浸提溫度90 ℃、浸提時間6 h、料水比1∶20、冷浸時間為13 h,此條件下提取的多糖經(jīng)過純化后,其分子量為5.59×104 Da,單糖含量比例(阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖)為1∶1∶28∶8∶12。經(jīng)測定,多糖具有一定的超氧自由基、羥自由基、DPPH自由基體外清除能力,在0.5~2.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi),清除率分別為12.3%~37.9%、12.3%~40.9%、15.3%~42.6%,說明抗氧化活性較好。結(jié)論:本研究可為山楂資源的開發(fā)利用和山楂多糖的藥理研究提供科學(xué)依據(jù)。

        關(guān)鍵詞:山楂多糖;提取;單糖組分;抗氧化

        山楂屬植物分布于北溫帶[1],山楂樹作為經(jīng)濟林遍布中國25個省、市、自治區(qū),被列為主要樹種之一。山楂是一種藥食同源的水果[2],營養(yǎng)豐富[3],具有促消化、抗氧化、降血壓等藥理作用[4-7],是一種值得開發(fā)利用的植物資源[8]。目前,關(guān)于山楂的化學(xué)成分研究較多集中于黃酮類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素、鞣質(zhì)等[9],但山楂中具有多種生物活性的山楂多糖卻被研究得較少,有研究采用水提醇沉法、超聲波提取法和微波提取法3種方法提取山楂中的多糖成分,初步確定多糖結(jié)構(gòu)是β型吡喃糖苷鍵構(gòu)型[10]。還有研究表明,山楂多糖促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化從而對免疫力有提升作用[11]。但是對于山楂多糖單一成分的提取及其抗氧化性的研究報道在國內(nèi)外仍較少,同時多糖的生物活性與其分子量和組成有密切關(guān)系。本文對山楂多糖的抗氧化活性、分子量、單糖組分以及利用水提醇沉法提取山楂多糖的最佳工藝條件進行了相關(guān)研究,為山楂資源的開發(fā)利用和山楂多糖的藥理研究提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        大果山楂,由無限極(有限)公司提供,購自廣東省信宜市大成填批發(fā)市場;水為純化水;無水葡萄糖、濃硫酸、苯酚、95%乙醇、無水乙醇、鹽酸、EDTA、維生素C,以上均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        752-N紫外分光光度計,上海精密儀器有限公司;氣相色譜儀(Agilent Technologies6890N,檢測器:FID)、色譜柱(Agilent19091N-113 HP-INNOWax Polyethylene Glycol,30.0 m×320 μm×0.25 μm),美國安捷倫公司;透析袋,BIOSHARP,截留分子量為7 000~14 000;SH 2-88臺式水浴恒溫器,江蘇太倉市試驗設(shè)備廠;型號為FA2004A的萬分之一電子分析天平,上海精天電子儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 多糖提取單因素試驗 按“1.3.1”進行操作,分別考察不同料水比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)、提取時間(2、3、4、5、6 h)、冷浸時間(10、11、12、13、14 h)對山楂多糖得率的影響,其中各因素的固定水平為料水比為1∶20、提取溫度為80 ℃、提取時間為4 h、冷浸時間為12 h。

        1.3.2 正交試驗優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,各因素選取影響顯著的3個水平,采用L9(34)正交表,各組試驗平行3次,取山楂多糖得率平均值進行極差分析(表1)。

        1.3.3 山楂多糖的提取 稱取5.0 g山楂粉末,溶于蒸餾水中,在選定的溫度、時間和料水比條件下水浴提取,過濾取濾液,55 ℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮,濃縮液加入4倍體積的無水乙醇在4 ℃下進行醇沉一定時間,離心,收集多糖沉淀,沉淀復(fù)溶于水,重復(fù)醇沉1次,沉淀依次用無水乙醇、丙醇反復(fù)洗滌3次,冷凍干燥后得到山楂粗多糖。

        1.3.4 山楂多糖的分離 稱量1.0 g山楂粗多糖于1 000 mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度。利用Sevage法脫蛋白透析48 h,依次經(jīng)濃縮、醇沉、洗滌,真空干燥得到多糖樣品[12]。

        1.3.5 多糖含量的測定與計算 本研究采用苯酚-硫酸法對山楂多糖含量進行測定[13]。

        1.3.6 多糖的單糖組分分析 (1)多糖的水解:準確稱量山楂多糖樣品20 mg,加入2 mL 2 mol/L的硫酸溶液,于沸水浴中水解2 h,取出冷卻后,加入5%碳酸鋇中和至中性,置于10 mL容量瓶中定容,再300 r/min離心5 min,上清液用氮氣吹干,得到單糖置于干燥器中保存?zhèn)溆肹14-15]。(2)多糖及樣品單糖的衍生化:具體的衍生化試驗操作可參照[16]進行,鹽酸羥胺、吡啶和醋酸酐加入量分別為11 mg、0.5 mL、1 mL,90 ℃水浴反應(yīng)40 min,得到的產(chǎn)物減壓蒸干,用1 mL氯仿溶解,進樣做GC分析。GC分析條件:①載氣:高純氮,氫氣流量50.0 mL/min、空氣流量400 mL/min、氮氣吹尾流量20.0 mL/min、恒定壓力8.79 psi、平均線速度34 cm/s;②氣化室溫度:240 ℃;③檢測器溫度:260 ℃;④程序升溫:140 ℃維持3 min,以10 ℃/min升至220 ℃,保持3 min,再以10 ℃/min升至240 ℃,保持3 min。分流比:20∶1,進樣量:1 μL。

        1.3.7 山楂多糖體外抗氧化活性測定[17-19]

        (1)多糖清除DPPH自由基能力測定:精確稱取山楂多糖,將其配置呈濃度為10 mg/mL的樣品儲備液,分別稀釋成濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的溶液。再精確稱取抗壞血酸定容,制成濃度為10 mg/mL 維生素C溶液并分別稀釋成濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL作參比。分別準確稱量不同濃度的山楂多糖溶液、抗壞血酸溶液各2 mL分別與2 mL提前配制的DPPH溶液(0.004 0 g DPPH,甲醇定容至100 mL,4 ℃冰箱避光放置)混合,搖勻后放置30 min,以相對應(yīng)的溶劑為對照,用紫外可見分光光度計分別測定上述溶液在波長為517 nm處的吸光度(AI)。2.0 mL不同濃度的樣品溶液與2.0 mL甲醇混合液測定樣品本底吸光度,2.0 mL DPPH與2 mL甲醇混合液測定對參比溶液吸光度。山楂多糖、抗壞血酸的抑制率計算公式為式(1):

        DPPH自由基清除率=(1-Ax-Ax0A0)×100%(1)

        式(1)中,Ax——不同濃度溶液吸光度、Ax0——樣品本底吸光度、A0——參比溶液吸光度。

        (2)多糖清除羥自由基能力測定:分別加入1.0 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1.0 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和不同濃度的樣品溶液于試管中,然后加入1.0 mL 8 mmol/L的過氧化氫溶液。迅速置于水浴鍋中水浴30 min,水浴溫度為37 ℃,用紫外可見分光光度計分別測定不同濃度的溶液在波長為510 nm處的吸光度。用蒸餾水代替H2O2測得對應(yīng)質(zhì)量濃度樣品溶液的本底吸光度值,用蒸餾水代替樣品溶液測得對照吸光度值。羥自由基清除率計算公式如式(2):

        羥自由基清除率=(1-Ax-Ax0A0)×100%(2)

        式(2)中,Ax——不同濃度溶液吸光度、Ax0——樣品本底吸光度、A0——參比溶液吸光度。

        (3)多糖清除超氧自由基能力測定:先加入0.01 mol/L Tris-HCI(pH 8.20,內(nèi)含1 mmol/L EDTA)緩沖液和二次蒸餾水,于25 ℃恒溫20 min后加入25 ℃預(yù)熱過的鄰苯三酚溶液(3 mmol/L鄰苯三酚于10 mmol/L HCI中),迅速搖勻,立即傾入光徑1 cm 比色杯中,在波長325 nm處每0.5 min測定1次吸光值A(chǔ)325 nm,自氧化速率控制在0.06 min左右,測定3.5 min。在上述Tris-HCI緩沖液中預(yù)先加入一定量的維生素C溶液,再按式(3)計算鄰苯三酚的自氧化速率,表示為每分鐘光密度變化值。

        超氧自由基清除率=(A0-AA0)×100%(3)

        式(3)中,A0——空白溶液光密度變化速率、A——樣品溶液光密度變化速率。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素對山楂多糖得率的影響

        2.1.1 料水比對山楂多糖得率的影響 由圖1可知,當料水比從1∶10增大到1∶30,山楂多糖得率先升高后下降,當料水比為1∶20時,山楂的多糖得率最高,為5.02%,可推測水用量的增加促進了傳質(zhì)過程的進行,從而增加多糖的溶出率,而過高的料水比可能會導(dǎo)致其他雜質(zhì)的溶出從而抑制多糖的溶出[20]。

        2.1.2 浸提溫度對山楂多糖得率的影響 由圖2可知,山楂多糖得率隨著浸提溫度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,當浸提溫度比為80 ℃時,山楂的多糖得率最高,為3.86%,可見溫度的升高會促進多糖的溶出,但過高的溫度可能會破壞多糖的結(jié)構(gòu)使其降解。

        2.1.3 浸提時間對山楂多糖得率的影響 由圖3可知,隨著時間的增長,多糖的得率呈上升的趨勢,當浸提時間為5 h時,山楂的多糖得率最高,為3.91%,此時再延長時間多糖得率稍微下降,因此浸提時間過程可能不利于多糖的溶出。

        2.1.4 冷浸時間對山楂多糖得率的影響 由圖4可知,當冷浸時間從10 h增大到14 h,山楂多糖得率先升高后下降,當冷浸時間為12 h時,山楂的多糖得率最高,為3.78%,可能時間過長時多糖會重新溶解于水中,因此選擇合適的時間不僅可以提高多糖的得率,還能縮短工業(yè)生產(chǎn)周期,提高提取效率。

        2.2 多糖提取的正交設(shè)計優(yōu)化試驗

        在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取各因素的3個顯著水平進行正交試驗設(shè)計。比較表2的極差大小可知,在選擇的4個因素中,對于多糖得率的影響大小,山楂的水浴溫度>水浴時間>浸泡時間>料液比,即各因素影響山楂多糖得率的主次順序為:A>B>D>C 。對此次正交試驗結(jié)果進行直觀分析,得到優(yōu)化組合為A3B3C2D3。從表2可以看出,山楂的提取水浴溫度為本試驗的顯著性因素,說明在試驗過程中此因素對試驗起主導(dǎo)因素,因此,山楂多糖提取優(yōu)化試驗的優(yōu)化工藝條件是浸提溫度90 ℃、浸提時間6 h、料水比1∶20、冷浸時間為13 h。

        2.3 穩(wěn)定性及驗證試驗

        采用浸提溫度90 ℃、浸提時間6 h、料水比1∶20、冷浸時間為13 h的條件進行驗證試驗。由表3可知,在最佳工藝條件A3B3C2D3下,山楂多糖的提取率為8.45%±0.04%,3次試驗的數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定,說明提取工藝可靠,有利于提高多糖的提取效率。

        2.4 山楂多糖的分子量測定及其單糖組分分析

        利用經(jīng)過正交試驗優(yōu)化后的工藝對山楂多糖進行提取,再利用Sevage法脫蛋白透析48 h,依次經(jīng)濃縮、醇沉、洗滌,真空干燥得到多糖樣品,用凝膠滲透色譜(GPC)對其分子量進行測定。結(jié)果如圖5所示,測得其分子量為5.59×104 Da。

        如圖6所示,可以通過各色譜峰與標準樣品的保留時間進行對比,從而得出樣品山楂多糖中的多糖組成。而組成多糖的各個單糖組分的含量可通過面積歸一法進行計算,單糖的質(zhì)量分數(shù)結(jié)果見表4。通過與標準品的色譜峰進行對比,可以得知山楂純化多糖的圖譜中出現(xiàn)了阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖這5個吸收峰,說明山楂多糖由這5種單糖組成。同時用面積歸一化法對其進行定量分析,這5種單糖的成分含量分別為阿拉伯糖2.00%、木糖2.01%、甘露糖56.50%、葡萄糖16.10%和半乳糖23.40%。

        2.5 山楂多糖的體外抗氧化性

        2.5.1 山楂多糖對超氧自由基的清除作用 由圖7可知,濃度為0.5~2.5 mg/mL的山楂多糖隨著濃度的上升,其對超氧自由基的清除率也隨著增大,清除率為12.3%~37.9%。而維生素C對于超氧自由基的清除率隨著濃度的增大而上升,在2.5 mg/mL時達到最大,其清除率為25.8%~90.6%。因此說明山楂多糖具有一定的超氧自由基清除活性,但弱于維生素C。

        2.5.2 山楂多糖對羥自由基的清除作用 由圖8可知,濃度為0.5~2.5 mg/mL的山楂多糖、維生素C溶液隨著濃度的上升,它們對羥自由基的清除率也隨著增大,清除率分別為12.3%~40.9%、16.3%~42.9%,山楂多糖對羥自由基清除率與維生素C的比較接近;以上結(jié)果說明,山楂多糖具有較好的羥自由基清除活性。

        2.5.3 山楂多糖對DPPH自由基的清除作用 由圖9可知,山楂多糖和維生素C的DPPH自由基清除活性都隨著濃度的增大而增大,在0.5~2.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi),二者的清除率分別為15.3%~42.6%和10.3%~88%,在0.5 mg/mL濃度處山楂多糖的清除能力稍強于維生素C,但從整體來看維生素C的DPPH清除能力要強于山楂多糖。以上結(jié)果說明,山楂多糖具有一定的DPPH自由基清除能力。

        3 討論

        本研究以單因素試驗為基礎(chǔ),利用正交試驗設(shè)計優(yōu)化水提醇沉法提取山楂多糖的工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn),水浴溫度和水浴時間對于山楂多糖的提取效果的影響最為顯著,其次是冷浸時間和料水比。同時得出最佳的提取工藝條件為浸提溫度90 ℃、浸提時間6 h、料水比1∶20、冷浸時間為13 h,并經(jīng)驗證試驗可得最優(yōu)提取工藝下得率為8.45%±0.04%。高鐸迅等[21]利用正交試驗優(yōu)化山楂多糖提取條件,最佳提取率為1.52%,而本研究通過將冷浸和水浴浸提法相結(jié)合,并且優(yōu)化提取步驟,提升提取率達到8.45%,說明進一步優(yōu)化了山楂多糖的提取條件,有利于對山楂多糖的開發(fā)。本研究還利用HPGFC方法測定了山楂純化多糖的分子量和單糖組成,結(jié)果確定了其分子量為5.59×104 Da,并且參照了各單糖標準品,得出其單糖成分主要是多糖的圖譜中出現(xiàn)了阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,經(jīng)過計算各單糖的相對含量分別為2%、2.01%、56.5%、16.1%和23.4%。與其他研究測定山楂多糖的單糖組成相比[22],檢測出了含量較高的甘露糖,但阿拉伯糖、木糖和甘露糖相對較低,也沒有檢測出核糖、鼠李糖和果糖。

        超氧自由基、羥自由基和DPPH自由基會產(chǎn)生引起細胞功能衰退、致癌和DNA損傷的活性氧,對生命有機體產(chǎn)生重大的影響[23]。有研究指出,山楂粗黃酮對DPPH具有一定的清除能力,對細菌也有較強的抑制作用[24]。還有研究證明,山楂果實中的原花青素具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的能力,具有和黃酮不完全相同的生理活性,尤其是抗氧化活性明顯強于黃酮[25-26]。山楂多糖具有抗疲勞、增強免疫力以及調(diào)血脂等藥理作用,尤其是山楂多糖的抗氧化能力與其抗衰老等功能有密切關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn),山楂多糖對超氧自由基、羥自由基和DPPH自由基均具有一定的清除能力,并且抗自由基活性隨著濃度的增大而增大。雖然對3種自由基的清除活性均低于維生素C,其中山楂多糖對于羥自由基的清除能力與維生素C最接近,但與同濃度的鹿茸多糖相比,山楂多糖對于3種自由基清除能力明顯強于鹿茸多糖[27],有研究表明,鹿茸多糖具有較強的自由基清除能力且能夠起到抗腫瘤作用,說明山楂多糖具備抗氧化、抗腫瘤的功效[28]。有研究發(fā)現(xiàn),具有高摩爾比例甘露糖的多糖很容易通過模式識別受體加以區(qū)分,從而有助于增強免疫調(diào)節(jié)[29]。另外,甘露糖具有抗氧化作用,可作為潛在的天然抗氧化劑來源[30-31]。因此山楂多糖中較高的甘露糖比例可能是其具有較好的抗氧化活性的原因,但具體的機制仍需要進一步的探究。通過以上的研究,可以更好地對山楂多糖進行開發(fā)利用,為其創(chuàng)新研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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        Optimization on Extraction Process and Antioxidant Activity of Hawthorn Polysaccharides

        ZHANG Quan-cai1,TIAN Wen-ni2,LUO Zhi-feng2,CHEN Hai-ping1,LI Pan2,DU Bing2,LI De-ling1

        (1Infinitus(China)Company Ltd.,Guangzhou 510623,China;2College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

        Abstract:【Objective】 To study the optimum process conditions for extraction of polysaccharides from hawthorn by hot water extraction,and study its structure and antioxidant activity in vitro.【Method】 On the basis of single factor experiment,the extraction process was optimized by orthogonal experiment design with water extraction temperature,water extraction time,feed water ratio and cold immersion time.After purification,the polysaccharides were analyzed by GPC and GC-MS for molecular weight and monosaccharide composition.The antioxidant activity of HP was determined by superoxide free radical,hydroxyl radical,DPPH free radical scavenging test.【Result】 The optimum extraction conditions were extraction temperature 90 ℃,extraction time 6 h,ratio of material to water 1∶20,cold soaking time 13 h.After purification of the polysaccharide extracted under this condition,the molecular weight was 5.59×104 Da.The ratio of monosaccharide content(arabinose∶xylose∶mannose∶glucose∶galactose)was 1∶1∶28∶8∶12,and the polysaccharide had certain ability to remove superoxide radical,hydroxyl radical and DPPH free radical in vitro,indicating better antioxidant activity.【Conclusion】 The research can afford scientific foundation for the development and utilization of hawthorn resources and the pharmacological research on hawthorn polysaccharides.

        Keywords:hawthorn polysaccharides(HP);extraction;monosaccharide component;antioxidant

        作者簡介:張全才(1983— ),男,碩士,研究方向:中草藥提取工藝。

        通信作者:李德靈(1974— ),男,高級工程師,研究方向:中草藥原料開發(fā)利用。

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