李瑾 李聰

黃曲霉毒素是寄生曲霉、模式曲酶以及黃曲霉在一定溫度條件下形成的真菌毒素，其對人體有較強的致癌性、致病性，同時也是嚴重的真菌毒素，B1、B2、G1、G2是污染糧食的重要黃曲霉毒素成分。根據(jù)我國有關規(guī)定，玉米、玉米面和玉米制品中，AFB1含量最高為20ug/kg。當前，對于黃曲霉毒素的檢測方法包括薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、膠體金試紙條法、液相色譜法、液質聯(lián)用法等，但這些方法都各有優(yōu)缺點。本研究結合免疫親和凈化，能夠基于高效液相色譜分離技術，構建微進量小、分離度較高、無需衍生的快速黃曲霉毒素定量、定性分析法。

一、材料與方法

1.儀器與材料。高效液相色譜儀，日本島津生產(chǎn)的NexeraUHPLC L-3a熒光檢測器；黃曲霉毒素免疫親和柱；玻璃纖維濾紙；0.22um有機濾膜；6位泵流操作架；電子分析天平；氮吹儀；超純水機；黃曲霉毒素樣品標準品；色譜純級別的甲醇溶液。

2.設置分析條件。本研究采用的色譜柱為C18柱。流動相為45：55，甲醇水溶液流速設置為每分鐘0.2mL，進樣量為2uL，柱溫設置為30℃，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為360nm和440nm。

3.樣品制備。首先，配置標準溶液。將黃曲霉毒素混標分別配置為B1濃度：2.0、10.0、5.0、20.0、50.0ng/mL，B2和G2的濃度為：0.48、1.20、2.40、4.80、12.00ng/mL，G1的濃度為：1.12、2.80、5.6、11.2、28ng/mL。

二、研究結果

下圖為黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的保留時間，其分別為4.003分鐘、3.176分鐘、2.533分鐘、2.052分鐘，所有峰走完后全程需5分鐘。

按照液相色譜法流動相中甲醇和水的比例為45：55、流速為0.8-1mL/min、出峰時間為15分鐘，檢測一個樣品需消耗色譜級甲醇5.4-6.75mL。而采用高效液相色譜進行檢測時，甲醇使用體積為0.45mL，相比國標方法可縮短檢測時間，減少有機溶劑的使用。

根據(jù)研究可以發(fā)現(xiàn)，在高效液相色譜中進行4種毒素檢測，其具有良好的線性關系，并且相關系數(shù)為0.9997，是符合樣品定量要求的。結合標準曲線最低點進行儀器靈敏度的計算，通過液相色譜工作站進行信噪比、儀器檢出限、定量限測定，如下表所示。

根據(jù)國標中黃曲霉毒素測定，采用免疫親和凈化的方式，使用普通HPLC分離柱后，碘溶液衍生熒光檢測玉米中黃曲霉毒素，其AFB1檢出限為100ug/kg。而本研究采用高效液相色譜進行檢測時，無需衍生，并且靈敏度可提高兩倍，其余黃曲霉毒素靈敏度也顯著提高。按照上述方法進行空白樣品加標，如下圖所示，為玉米樣品的加標色譜圖。根據(jù)該結果可以發(fā)現(xiàn)，加標實驗回收率達93.9%-104%，是符合國標中玉米樣品回收率80%-120%要求的。

總之，本文構建了超高效液相色譜測定玉米中黃曲霉毒素的方法，通過研究發(fā)現(xiàn)，本研究具有良好的線性，且相關系數(shù)為0.9997，劑量為UL，樣品加標回收率達93.9%-104.4%，相比普通液相色譜法來說，無需經(jīng)過衍生處理，能夠節(jié)約檢測的時間，減少有機溶劑的使用量，操作相對簡單、靈敏度較高，可用于糧食中黃曲霉毒素的快速測定。