徐志高，巫輔達(dá)，張先東，羅 穎，康天灝，鄧 樺，楊 鴻

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000)

玉屏風(fēng)散最早出自宋代張松所著的《究原方》中，是中醫(yī)扶正固本的經(jīng)典方劑，由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味中藥按3∶ 1∶ 1的比例組成[1-2]。玉屏風(fēng)多糖(Yupingfeng polysaccharides，YPF-P)是玉屏風(fēng)散的有效部位群，是該方劑臨床藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，在調(diào)節(jié)免疫、抗應(yīng)激、抗病毒以及抗疲勞等方面發(fā)揮著重要作用[3-4]?？诜o藥是目前中藥方劑的主要給藥途徑，藥物進(jìn)入機(jī)體后，主要經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)，最后發(fā)揮生物活性，但傳統(tǒng)的中藥多糖制劑存在著易被氧化分解、受潮易變質(zhì)以及不易吸收等缺陷[5]。脂質(zhì)體(liposome)是具有類似生物膜雙分子層結(jié)構(gòu)的超微球型載體，具有良好的生物組織相容性、緩釋作用、穩(wěn)定性，是一種極具開發(fā)潛力的新型給藥載體[6]。前期工作研究發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)多糖脂質(zhì)體(YPF-PL)具有良好的穩(wěn)定性、緩釋作用等，本試驗(yàn)建立雛雞在體小腸循環(huán)灌流模型，以YPF-P為對(duì)照，觀察YPF-PL在雛雞小腸的吸收特性，為YPF-PL新型制劑的研發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器防風(fēng)、黃芪和白術(shù)3味中藥購(gòu)自北京同仁堂大瀝分店；YPF-P(含量：92.57%)和 YPF-PL(包封率：86.66%)為實(shí)驗(yàn)室自行制備；大豆卵磷脂和膽固醇購(gòu)自合肥博美生物科技有限公司；賽拉嗪購(gòu)自吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司；色譜級(jí)甲醇和乙腈購(gòu)自美國(guó)Fisher scientific公司。

真空冷凍干燥機(jī)購(gòu)自美國(guó)LABCONCO公司；LC-15C高效液相色譜儀購(gòu)自島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；BT100LC/25蠕動(dòng)泵購(gòu)自保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12只45日齡SPF雛雞，雄性，體質(zhì)量(221±8)g，購(gòu)自新興大華農(nóng)禽蛋有限公司，動(dòng)物許可證為SCXK(粵)2018-0019。

1.3 雛雞在體循環(huán)灌流模型的建立將12只45日齡SPF雛雞隨機(jī)分為2組，分別為YPF-PL和YPF-P組，每組3只，其中YPF-PL組循環(huán)灌流質(zhì)量濃度為20 g/L的YPF-PL 150 mL，YPF-P組循環(huán)灌流質(zhì)量濃度為20 g/L的YPF-P 150 mL。試驗(yàn)前將SPF雛雞禁食不禁水24 h，稱體質(zhì)量，腹腔注射賽拉嗪(0.2 mL/kg)麻醉，麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，剪毛，打開腹腔4～5 cm，輕柔取出雛雞小腸(保持腸系膜完整)，并在所研究的腸段兩端(小腸全腸段、十二指腸、空腸和回腸)各插入硅膠管并縫合固定，連接恒流泵和灌流液，形成閉合的循環(huán)回路。用41℃的生理鹽水沖洗腸段，待腸段內(nèi)容物排凈后，用空氣將生理鹽水排空，換上預(yù)熱至41℃的灌流液，并置于恒溫磁力攪拌器上(41℃，300 r/min)，以5 mL/min 的灌流速度平衡10 min，然后調(diào)至2.5 mL/min 恒速灌流，此時(shí)計(jì)時(shí)開始。用移液器采樣2.5 mL于5 mL離心管中，之后分別在不同的時(shí)間點(diǎn)采樣(15，30，45，60，90，120，180，240 min)，每次采樣后補(bǔ)加2.5 mL生理鹽水，循環(huán)灌流4 h后結(jié)束試驗(yàn)，剪下試驗(yàn)?zāi)c段，測(cè)量腸段長(zhǎng)度以及半徑。

試驗(yàn)中雛雞小腸吸收藥物的同時(shí)，也會(huì)吸收大量水分，導(dǎo)致供試液體積變化，因此試驗(yàn)時(shí)應(yīng)對(duì)供試液體積進(jìn)行校正[7]。在循環(huán)灌流試驗(yàn)過程中，每次采樣之前應(yīng)該快速用量筒量取燒杯中供試液的體積(Vn)，待試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用空氣排出硅膠管和腸道內(nèi)的供試液并量取液體體積，此體積為循環(huán)回路中腸道與管道的固定體積(V固)，再與燒杯中供試液體積相加，即得該時(shí)間點(diǎn)供試液的總體積(Vtn)。

1.4 測(cè)定方法脂質(zhì)體破乳：分別取空白脂質(zhì)體灌流液和YPF-PL灌流液各2.5 mL于15 mL的離心管中，加入10 mL 50%甲醇溶液，充分混勻，超聲處理2 min，對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行破乳。對(duì)YPF-P灌流液采用相同方法處理。

本試驗(yàn)采用柱前衍生化法測(cè)定YPF-P中各單糖組分含量[8]，以含量最高的葡萄糖為參考單糖計(jì)算所取樣品中的YPF-P含量。

利用相應(yīng)公式計(jì)算出各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，其中腸吸收速率常數(shù)(Ka)、藥物4 h累計(jì)吸收轉(zhuǎn)化率(A，%)、藥物吸收半衰期(T1/2,h)、以及表觀滲透系數(shù)(Papp,cm/s)的計(jì)算公式為[9-11]：

公式中Ptn為t時(shí)刻供試液剩余藥量，Pt0為0時(shí)刻供試液剩余藥量，Pt4為4 h供試液剩余藥量，Δt為時(shí)間變化量，Ctn為t時(shí)刻供試液中藥物質(zhì)量濃度，ΔQ為灌流4 h吸收總量，r為腸道半徑，l為腸道長(zhǎng)度。

2 結(jié)果

2.1 YPF-PL在雛雞小腸全腸段累計(jì)吸收量對(duì)雛雞在體小腸循環(huán)灌流YPF-PL和YPF-P，結(jié)果顯示，YPF-PL和YPF-P在不同時(shí)間段均有不同程度吸收，且灌流4 h結(jié)束后雛雞對(duì)YPF-PL的吸收量顯著高于YPF-P(P<0.05)(圖1)。

圖1 小腸吸收藥物量與時(shí)間曲線圖

2.2 YPF-PL和YPF-P吸收參數(shù)比較通過建立HPLC分析方法，測(cè)得不同時(shí)間點(diǎn)循環(huán)回路中剩余藥量，代入吸收動(dòng)力學(xué)公式，即得YPF-PL和YPF-P各吸收參數(shù)(表1)。YPF-PL在雛雞小腸的平均Ka、A、Papp比YPF-P分別提高了35%，26%,20%，T1/2縮短了26%，且均具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 YPF-PL與YPF-P在不同腸段吸收情況利用雛雞在體腸循環(huán)灌流模型，通過灌流相同質(zhì)量濃度的YPF-PL和YPF-P分別考察十二指腸、空腸、回腸吸收特性，經(jīng)計(jì)算得YPF-PL和YPF-P在雛雞不同腸段的Ka和A(圖2)。YPF-PL和YPF-P在雛雞小腸的單位吸收量大小順序均為空腸>回腸>十二指腸；與YPF-P相比，YPF-PL在雛雞各腸段的吸收均有所提高，在十二指腸、空腸、回腸段的Ka分別提高了17%，28%，12%，吸收轉(zhuǎn)化率分別提高15%，23%，19%，且均具有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 YPF-PL和YPF-P吸收參數(shù)

注：在相同腸段中，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

3 討論

近年來，學(xué)者對(duì)中藥多糖的研究主要集中在藥理作用上，對(duì)其吸收動(dòng)力學(xué)的研究嚴(yán)重不足，目前普遍認(rèn)可的多糖吸收機(jī)制有3種：直接吸收機(jī)制、腸道菌群吸收機(jī)制以及腸道派伊爾氏集合淋巴結(jié)吸收機(jī)制[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠口服同位素125I標(biāo)記的透明質(zhì)酸后，能在血液中發(fā)現(xiàn)同位素125I標(biāo)記的透明質(zhì)酸，利用透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白與透明質(zhì)酸的特異結(jié)合性以及色譜柱Sephadxe G-50對(duì)透明質(zhì)酸分子鏈大小的分離作用，發(fā)現(xiàn)口服透明質(zhì)酸后，胃腸道以單糖及非單糖(包括寡糖和多糖)2種形式吸收[13]。母乳中有多種大小不一、結(jié)構(gòu)不同的多糖，其中人乳寡糖是其中1種，其含量豐富，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不能被胃腸道直接消化，但研究發(fā)現(xiàn)人乳寡糖可被腸道內(nèi)定植的微生物菌群所水解，產(chǎn)生小分子有機(jī)酸，最終被胃腸道吸收分解，并促進(jìn)了鈣、鎂、鐵等礦物質(zhì)的吸收以及降低了胃腸道的pH值[14]。給大鼠飼喂2%巖藻依聚糖2周后，取其腸道組織，經(jīng)免疫組化染色后，發(fā)現(xiàn)巖藻依聚糖大量積累在空腸上皮細(xì)胞和空腸固有層中的單核細(xì)胞，在一定程度上表明多糖可能被派伊爾氏集合淋巴結(jié)吸收[15]。

中藥多糖脂質(zhì)體是指將中藥多糖包封于脂質(zhì)體囊膜內(nèi)，而脂質(zhì)體由磷脂和膽固醇組成，屬脂溶性物質(zhì)，可利用細(xì)胞膜兩側(cè)的濃度差，直接由高濃度向低濃度一側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)，既不需消耗能量，也不需要載體蛋白的協(xié)助。中藥多糖脂質(zhì)體也可以通過胞吞胞飲的方式進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，當(dāng)脂質(zhì)體與腸上皮細(xì)胞接觸時(shí)，脂質(zhì)體囊膜與細(xì)胞膜相互融合，最后被胞內(nèi)的多種降解酶降解[15-16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在小腸全腸段考察中，YPF-PL和YPF-P在不同時(shí)間段均有不同程度吸收，且雛雞小腸對(duì)YPF-PL 4 h累計(jì)吸收量顯著高于YPF-P(P<0.05)；YPF-PL在雛雞小腸平均Ka、A、Papp比YPF-P分別提高了35%，26%,20%，T1/2縮短了26%；提示將YPF-PL包載于脂質(zhì)體中,提高了雛雞小腸對(duì)YPF-P的吸收速度，增加了YPF-P在小腸的單位吸收量,進(jìn)而提高了YPF-P的生物利用度。在不同腸段考察中，YPF-PL和YPF-P在雛雞不同腸段的Ka和A的大小順序均為空腸>回腸>十二指腸；與YPF-P相比，YPF-PL在雛雞各腸段的吸收量均有所提高，在十二指腸、空腸、回腸的Ka分別提高了17%，28%,12%，A分別提高15%，23%,19%，且均具有極顯著性差異(P<0.05)，表明YPF-PL和YPF-P在雛雞十二指腸、空腸、回腸都有不同程度的吸收，吸收速率和單位吸收量大小均為空腸>回腸>十二指腸，且與YPF-P相比，YPF-PL在雛雞各腸段吸收量均有所提高，增強(qiáng)了療效。

綜上所述，YPF-PL和YPF-P在雛雞十二指腸、空腸和回腸都有不同程度的吸收，吸收速率和單位吸收量大小順序均為空腸>回腸>十二指腸，與YPF-P相比，雛雞小腸對(duì)YPF-PL的吸收速率快，單位吸收量明顯增加，生物利用度高。