甘軍紀，呂海峰，湯 也，田曉彥，劉秀梵

(揚州大學 獸醫(yī)學院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省人獸共患病重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

犬冠狀病毒(canine coronavirus,CCV)是一種單股正鏈RNA病毒，通常引起犬輕度到嚴重的胃腸炎。盡管CCV感染通常局限于腸道，但近年來出現(xiàn)的泛嗜型 CCV變異株，能引起幼犬全身性和致死性感染[1]。犬胃腸炎可由多種病原體引起，包括病毒、細菌或寄生蟲。最常見的病毒性腸炎病原體除了CCV，還有犬細小病毒(CPV)[2]、犬腺病毒2型(CAV-2)和犬瘟熱病毒(CDV)等[3]。因此，快速的病毒學檢測對控制犬病毒性腸炎疾病至關(guān)重要。

CCV基因組全長約30 kb，5′端有2個大開放閱讀框(ORFs)， 1a和1b，其編碼病毒復制酶多聚蛋白。ORF1b的下游有幾個小ORFs，通過亞基因組mRNA表達，編碼幾個結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。CCV結(jié)構(gòu)蛋白有4種，分別為刺突蛋白(S，170～220 kDa)，小膜蛋白(E或SM，9.2 kDa)，膜蛋白(M，32 kDa)和核衣殼蛋白(N，43～50 kDa)[4-6]。S糖蛋白形成冠狀病毒的特征性刺突，參與病毒粒子與宿主細胞受體結(jié)合以及介導病毒-細胞和細胞-細胞融合，主要誘導中和抗體，與病毒毒力相關(guān)[7-8]。小膜蛋白(E)是一種8～12 kDa的小多肽，在病毒粒子的包膜中發(fā)現(xiàn)含量很少，但是病毒出芽所必須的，與M蛋白一起，對病毒包膜的組裝很重要。M蛋白是一種膜結(jié)構(gòu)糖蛋白，在包膜蛋白中含量最高，是一種Ⅲ型糖蛋白，由短的氨基端外結(jié)構(gòu)域、三跨膜結(jié)構(gòu)域和長羧基端內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成[9-10]，是病毒組裝和形成的關(guān)鍵成分，含有B細胞識別表位。冠狀病毒核衣殼(N)是一種與基因組RNA所形成的復合物，在病毒粒子裝配過程中與病毒膜蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)蛋白，對提高病毒轉(zhuǎn)錄和裝配效率起著至關(guān)重要的作用，N 蛋白是CCV第二大結(jié)構(gòu)蛋白[11]。雖然冠狀病毒S蛋白在免疫中起主要作用，但M蛋白的氨基和羧基末端都能引起強烈的免疫反應，M蛋白可誘導抗體依賴-補體介導的病毒中和作用[12]。

在冠狀病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白變異較大，其S1區(qū)(氨基端)在不同屬中表現(xiàn)出非常低的同源性，相比之下，S2區(qū)(羧基端)高度保守。M、N蛋白在同屬冠狀病毒中均有較好的保守性，但在各屬間差異較大。主要結(jié)構(gòu)蛋白保守性排序為 N>M>S,因此，在CCV 的診斷方面,研究 M和 N 蛋白的意義可能更大一些[11]。本研究通過雜交瘤技術(shù)獲得CCV M、N蛋白單抗，并對其生物學特性進行分析鑒定，為CCV診斷試劑的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒CCV株(JS1706，JS1712株)，由揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室分離、鑒定；CDV、CAV-2和CPV-2a/2b/2c毒種，由揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室分離、保存。相關(guān)病毒毒株來源、培養(yǎng)細胞和用途見表1。

表1 病毒毒株、細胞與用途

1.2 細胞A-72細胞(ATCC，CRL-1542)、Vero細胞、MDCK細胞、FK81細胞、Vero-DST (DogSLAM)、 SP2/0細胞均由揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室保存、提供；SP2/0細胞用15%FBS-HT-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他細胞均用10%FBS-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶-EDTA、HT(100×)、HAT(50×)購自Gibco公司；秋水仙堿、PEG6000，購自國藥集團；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；FITC-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗鼠IgG購自SouthernBiotech公司；PEG1500購自Roche公司；小鼠單抗亞類鑒定ELISA試劑盒購自Sino Biological公司；Endo H、 PNGase F,購自NEB公司；增強型ECLPlus化學發(fā)光試劑、ECL Plus超敏發(fā)光液、SDS，購自Solarbio公司；0.2 μm NC膜購自GE Healthcare lifescience公司；預染蛋白質(zhì)Marker(16-270KD)購自碧云天公司；脫脂乳購自伊利公司；吐溫-20，購自Sangon Biotech公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 CCV抗原純化按參考文獻[5,13]方法，稍做改變。取CCV JS1706株病毒的A-72細胞培養(yǎng)物，4 000 r/min離心20 min，取上清液加入10% PEG6000，攪拌溶解后，4℃放置過夜。4 000 r/min，4℃離心30 min，棄掉上清，沉淀物加入NTE緩沖液 (0.1 mol/L NaCl,0.01 mol/L Tris-HCl,pH 7.4的1 mmol/L EDTA)重新懸浮至原體積1/10，再加到蔗糖墊(含30% 蔗糖-TNE緩沖液)上，140 000×g離心1.5 h，沉淀物加TNE緩沖液到原體積的1/50。測定純化病毒的蛋白濃度，分裝，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雜交瘤細胞株建立與單抗隆抗體制備

1.5.1動物免疫 取純化的CCV抗原(1.6 g/L)，0.1%甲醛滅活24 h，作為免疫抗原。第1次免疫，抗原+弗氏完全佐劑1∶1混合乳化，腹腔注射免疫8周齡BALB/c小鼠，0.2 mL/只(160 μg)。間隔2周分別進行相同抗原第2，3次接種，使用弗氏不完全佐劑。第4次免疫，不使用佐劑，皮下注射純化抗原0.1 mL。

1.5.2雜交瘤細胞株建立 BALB/c小鼠第4次免疫后3～4 d，按常規(guī)方法取免疫小鼠脾細胞與SP2/0進行細胞融合[14]。小鼠的脾細胞與 SP2/0骨髓瘤細胞比例約5∶1，融合劑PEG1500 (Roche,USA)，選擇培養(yǎng)基HAT，融合細胞分裝96孔板，5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。融合后8～10 d，用CCV感染細胞96孔板進行IFA試驗篩選陽性雜交瘤細胞。陽性雜交瘤細胞用HT培養(yǎng)基經(jīng)有限稀釋法進行3次克隆化，選擇穩(wěn)定分泌高特異抗CCV的單克隆抗體雜交瘤細胞株進行擴大培養(yǎng)，液氮中凍存。

1.5.3 單抗小鼠腹水的制備8～10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射石蠟油0.5 mL/只，6～7 d后，腹腔注射雜交瘤細胞2×106/只，6～7 d小鼠腹部膨大時，用注射器針頭采集腹水，4 000 r/min，離心10 min取上清(最上層脂質(zhì)棄去)，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩FA、ELISA法測定抗體效價。

1.6 間接免疫熒光試驗(IFA)A-72細胞，用10%FBS DMEM培養(yǎng)基方瓶(25 cm2Flask，Corning)，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞形成致密單層后，0.25%胰酶-EDTA消化，分裝96孔板，培養(yǎng)24 h，形成單層后，接種1%FBS DMEM培養(yǎng)基稀釋的CCV，100 μL/孔(含100～300 TCID50)，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，冷甲醇固定4 h以上，棄甲醇、空干，4℃保存、備用(3個月內(nèi)使用)。取上述96孔細胞板，加雜交瘤(mAb)培養(yǎng)上清，37℃水浴箱孵育40 min；PBS洗滌3次，加1∶500稀釋的FITC-羊抗鼠IgG，37℃水浴箱孵育40 min；PBS洗滌3次，空干，倒置熒光顯微鏡下觀察。細胞內(nèi)有特異免疫熒光的判定為IFA檢測陽性。

1.8 單抗亞類鑒定按小鼠單抗亞類鑒定ELISA試劑盒(Sino Biological)說明書進行。

1.9 Western blot分析純化的CCV蛋白，加5×的蛋白上樣緩沖液，沸水煮10 min裂解，進行SDS-PAGE電泳；電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜(NC)上，用5%脫脂乳(PBST)室溫封閉3 h，mAb 4℃過夜孵育；PBST洗滌3次，每次10 min；NC膜放入按1∶10 000 稀釋的HRP羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h；PBST洗滌二抗作用后的NC膜2次，每次10 min；將NC膜用吸水紙吸干，把增強型ECL化學發(fā)光試劑盒均勻涂抹在NC膜上(1 min)，避光曝光，成像系統(tǒng)(Tanon 5200)掃描、分析。

1.10 M、N蛋白去糖基化分析為了證明M、N蛋白是否糖基化，取純化的CCV蛋白20 μg,分別用 endo H、 PNGase F 和endo H+ PNGase F (NEB公司,美國)37℃處理1 h進行去糖基化，具體操作按說明書。取 10 μL進行 SDS-PAGE(未處理的CCV蛋白作為對照)， 轉(zhuǎn)膜后分別用抗M蛋白單抗(2G3)、抗N蛋白單抗(2B8)按1.9進行 Western blot 分析。

1.11 雜交瘤細胞染色體組型分析雜交瘤細胞傳代后48 h，加入終濃度為0.1 mg/L的秋水仙堿(秋水仙素)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，1 000 r/min離心去上清，加入5 mL 37℃預熱的0.5% KCl低滲液，混勻，37℃水浴20 min，加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸=3∶1)1 mL， 3次固定后制片，姬姆薩染色，鏡檢、計數(shù)、拍照[15]。

1.12 單抗的特異性鑒定96孔板培養(yǎng)的A-72、Vero(Vero-DST)、MDCK、FK81細胞形成單層后，分別接種CCV(JS1706、JS1712)、CDV、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒(CAV-2)和CPV-2/2a/2b/2c， 100 μL/孔(含100～300 TCID50)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。CCV培養(yǎng)24 h，其他病毒培養(yǎng)72 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，冷甲醇固定4 h(或過夜)，加mAb培養(yǎng)上清進行間接免疫熒光(IFA)檢測，試驗程序同1.6。

1.13 雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定性試驗經(jīng)3次克隆化的CCV陽性雜交瘤細胞，液氮凍存后，復蘇、培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)至40代，IFA、ELISA試驗檢測1～40代細胞培養(yǎng)上清的單抗效價。

2 結(jié)果

2.1 CCV抗原純化先后純化3批次CCV抗原，病毒蛋白含量為1.6～3.3 g/L。

2.2 CCV陽性雜交瘤細胞株的建立先后進行6批次細胞融合試驗，IFA檢測共獲得陽性雜交瘤細胞株13株。經(jīng)傳代、連續(xù)3次克隆化、液氮凍存，能穩(wěn)定分泌CCV抗體的雜交瘤細胞株僅4株(分別來源于不同的融合批次)，分別命名為2H11、2G3、3E2和2B8。

2.3 間接免疫熒光試驗4株雜交瘤培養(yǎng)上清mAb，均與CCV感染細胞反應，呈現(xiàn)特異性細胞免疫熒光(圖1)。

2.4 單抗亞類經(jīng)mAb Ig亞類ELISA試劑盒鑒定，2H11為IgG3亞類，2G3、3E2和2B8均為IgG1亞類。

2.5 Western blot分析根據(jù)CCV JS1706 的M、N蛋白氨基酸序列(GenBank登錄號： MN078152,MN163040)預測的M、N蛋白相對分子質(zhì)量分別為29，43 kDa,M蛋白有3個潛在的N-糖基化位點[10]，N蛋白有4個潛在的N-糖基化位點。Western blot結(jié)果表明，2H11和2G3單抗識別蛋白帶與預測的CCV M蛋白相對分子質(zhì)量基本相符； 3E2和2B8單抗識別蛋白帶條帶與預測的CCV N蛋白相對分子質(zhì)量基本相符。M和N蛋白分別出現(xiàn)2個不同的條帶可能與蛋白修飾有關(guān)。純化CCV抗原免疫的小鼠血清(Serum)也能識別相應的蛋白條帶(圖2)。

1.2H11；2.2G3；3.3E2；4.2B8；M.預染蛋白質(zhì)Marker

2.6 M、N蛋白去糖基化CCV蛋白經(jīng)去糖基化酶Endo H、PNGase F和Endo H+PNGase F消化處理，M蛋白單抗(2G3)Western blot 分析結(jié)果見圖3A，酶消化后的蛋白相對分子質(zhì)量有明顯變化，Endo H和PNGase F去糖基化效果類似，表明單抗識別M蛋白的相對分子質(zhì)量差異(M、M1、M0)是由于M蛋白糖基化程度不同引起。N蛋白單抗(2B8)Western blot 分析結(jié)果見圖3B，酶消化后的N蛋白相對分子質(zhì)量沒有發(fā)生明顯變化，提示其可能非糖基化修飾。

A.M蛋白單抗(2G3)Western blot 分析；B.N蛋白單抗(2B8)Western blot 分析。M.預染蛋白Marker；1,5.未處理CCV蛋白；2,6.Endo H處理；3,7.PNGase F處理;4,8.Endo+ H PNGase F處理

2.7 雜交瘤細胞染色體組型分析正常小鼠脾細胞染色體數(shù)目為40條，SP2/0細胞染色體數(shù)目為62～68條，雜交瘤細胞染色體數(shù)目應接近于兩種親本細胞染色體數(shù)目的總和。M蛋白單抗雜交瘤細胞株2H11染色體數(shù)為(95.73±3.57)，2G3染色體數(shù)為(98.45±8.15)；N蛋白單抗雜交瘤細胞株3E2染色體數(shù)為(98.27±3.72)、2B8染色體數(shù)為(99.09±4.70)，均屬于雜交瘤染色體組型(圖4)。

2.8 單抗特異性IFA試驗結(jié)果見表2，4種CCV單抗隆抗體僅與CCV(JS1706、JS1712)反應，不與CDV、犬腺病毒(CAV-2)、CPV-2/2a/2b/2c和CPIV反應，具有高度的特異性。

2.9 雜交瘤分泌抗體的效價與穩(wěn)定性雜交瘤細胞2H11、2G3培養(yǎng)上清的IFA效價為1∶1 000，ELISA效價均≥1∶105； 2B8、3E2的IFA效價為1∶100，ELISA效價分別≥1∶105，≥1∶103。在體外連續(xù)傳40代(P0～P40)，各代次培養(yǎng)上清的IFA、ELISA檢測結(jié)果見表3，抗體滴度維持穩(wěn)定，說明這4株雜交瘤細胞可在體外長期培養(yǎng)，并能穩(wěn)定分泌抗體。

A.2H11染色體;B.2G3染色體;C.3E2染色體;D.2B8染色體

表2 CCV 單抗隆抗體IFA試驗特異性

表3 連續(xù)傳代的雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清中分泌抗體的穩(wěn)定性

3 討論

冠狀病毒M蛋白是最豐富的膜結(jié)構(gòu)蛋白，在冠狀病毒組裝中起核心作用，與幾乎所有其他病毒粒子成分相互作用[17]。N蛋白是冠狀病毒感染細胞后產(chǎn)生的主要抗原，也是病毒的主要靶點之一。S蛋白似乎在裝配中起被動作用，通過分泌途徑的過程中，被M蛋白捕獲并與病毒粒子結(jié)合。冠狀病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白S∶N∶M物質(zhì)量的比在不同的報告中略有差異[18]，平均為1∶8∶12，盡管也有報道稱M∶N達到3[19]。E蛋白豐度低且體積小[18]。另一方面，S蛋白變異較大，且同屬冠狀病毒的S蛋白有抗原相關(guān)性，因此S蛋白抗體在同屬冠狀病毒中存在交叉反應[20]，而M、N蛋白相對保守。從CCV 的診斷方面考慮， 應重點關(guān)注M 和 N 蛋白的作用。

在大多數(shù)有囊膜病毒中,其囊膜蛋白含有糖基化修飾，這種修飾對其穩(wěn)定性、免疫原性、免疫逃逸和生物學功能具有重要意義[21-22]。冠狀病毒M蛋白通常是一類不同糖基化蛋白，包括未糖基化的前體，相對分子質(zhì)量為20～38 kDa。CCV JS1706、JS1712株M蛋白預測的相對分子質(zhì)量為29 kDa，有3個潛在的N-糖基化位點(Asn-X-Thr 或 Asn-X-Ser)[10]。如果按每個糖鏈對總相對分子質(zhì)量貢獻2.1 kDa計算，全部糖基化M蛋白大約35 kDa，這一數(shù)值略高于本試驗結(jié)果(圖3)，可能是由于不是所有的潛在糖基化位點都發(fā)生糖基化[21]。理論上，用去糖基化酶Endo H消化，可水解高甘露糖N -鏈寡糖，去糖基化酶PNGase F消化，可以水解幾乎所有類型的N-多糖鏈。本研究中， M蛋白經(jīng)去糖基化酶處理后相對分子質(zhì)量降低，說明糖側(cè)鏈有效去除[23]。CCV JS1706、JS1712株N基因編碼382個氨基酸，預測相對分子質(zhì)量約43 kDa。雖然N蛋白分子上含有4個潛在N-糖基化一致序列，但普遍認為磷酸化是唯一已知的冠狀病毒N蛋白的翻譯后修飾。磷酸化的作用還不很清楚，但被認為會觸發(fā)N蛋白的構(gòu)象變化，并可能增強N蛋白對病毒RNA的親和力。本研究中， N蛋白經(jīng)去糖基化酶處理后的相對分子質(zhì)量無明顯變化，證明CCV N蛋白未發(fā)生糖基化，與VENNEMA等[24-25]的觀察結(jié)果類似。一些研究也指出，在免疫印跡試驗中存在1種或多種N蛋白條帶 (相對分子質(zhì)量相差2～5 kDa，有時被命名為N′、N″等)，是由于N蛋白磷酸化的結(jié)果[16]。本研究中， CCV M、N蛋白特異單抗識別相應蛋白的相對分子質(zhì)量差異應與M蛋白糖基化、N蛋白磷酸化相關(guān)。

單抗隆抗體因其高特異性、高效價、高純度、低成本并可以大量生產(chǎn)的特點，在目前的疾病診斷與治療中具有較大的優(yōu)越性。本研究建立4株穩(wěn)定分泌抗CCV單抗隆抗體的雜交瘤細胞株，其中2株單抗針對CCV M蛋白，另外2株單抗針對CCV N蛋白。4株單抗均具有高度特異性，效價高，與其他相關(guān)犬病毒無交叉反應，體外連續(xù)傳代培養(yǎng)40代能穩(wěn)定分泌抗體，可適用于規(guī)?；a(chǎn)與應用。本研究成功建立了抗CCV M、N蛋白特異單克隆抗體雜交瘤細胞株，為CCV鑒定和相關(guān)診斷方法的建立奠定良好的基礎。