張銳

腎癌是泌尿系常見的惡性腫瘤之一[1]，針對(duì)腎癌的相關(guān)研究一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，基于前期的研究成果，推測“在腎癌發(fā)病的過程中，MiR-23a調(diào)控著腫瘤增殖、凋亡、侵襲等過程，其作用的結(jié)合位點(diǎn)是靶基因HOXC8[2]。為了證實(shí)該假說，本研究通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用MiR-23a inhibitor基因沉默的方法作為研究手段，觀察MiR-23a及HOXC8在腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)和MiR-23a對(duì)腎癌細(xì)胞的生物學(xué)影響，并在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證，揭示MiR-23及HOXC8在腎癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)規(guī)律[3]，以及MiR-23a在腎癌細(xì)胞的生物學(xué)作用，從新的角度揭示腎癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的新的機(jī)制，為源頭防治腎癌提供新的思路及治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選取2019年1月培養(yǎng)的大鼠60例，MiR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染組（實(shí)驗(yàn)組）20例，空載體轉(zhuǎn)染組20例（陰性對(duì)照組），空白組20例（空白對(duì)照組）。所有大鼠均進(jìn)行體內(nèi)與體外兩種實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)施方法主要包括細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、引物擴(kuò)增、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）實(shí)驗(yàn)方法、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。

1.2 方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng)：腎癌細(xì)胞株HK-2，786-O，CAKI-1均采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其內(nèi)含1%青鏈霉素的雙抗和10%始牛血清。置于5%二氧化碳、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期用于實(shí)驗(yàn)。（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染（適用于MiR-23a inhibitor）：①將對(duì)數(shù)生長期的HK-2，786-O,CAKI-1細(xì)胞，分別用胰酶消化，用完全培養(yǎng)基收集細(xì)胞，以3.0×105/孔的密度接種于六孔板，接種后將細(xì)胞混懸液搖勻，常規(guī)條件培養(yǎng)。②過夜培養(yǎng)過后的細(xì)胞，狀態(tài)生長良好，融合密度達(dá)到50%～60%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為三組，每組均設(shè)復(fù)孔，以平衡實(shí)驗(yàn)誤差。分組：MiR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染組（實(shí)驗(yàn)組）：MiR-23a inhibitor+轉(zhuǎn)染試劑。空載體轉(zhuǎn)染組（陰性對(duì)照組）：MiRNA inhibitor negative control+轉(zhuǎn)染試劑（negative control）。空白組（空白對(duì)照組）：單加轉(zhuǎn)染試劑（blank control）。③配制轉(zhuǎn)染工作溶液。④細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 h，釆用無血清培養(yǎng)基POTI MEMI更換細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，預(yù)處理約1 h。⑤MiR-23a inhibitor的終濃度：1.5 μmol/L。⑥轉(zhuǎn)染后24 h，采集2 mL新鮮的完全培養(yǎng)基更換轉(zhuǎn)染體系。隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要在合適的時(shí)間節(jié)點(diǎn)收集細(xì)胞，予進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。（3）細(xì)胞總RNA提取。（4）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、引物擴(kuò)增。（5）實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)方法，MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲，Western Blot實(shí)驗(yàn)。（6）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：常規(guī)飼養(yǎng)→細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染同上→皮下（左側(cè)腹股溝）接種，控制腫瘤大小10～15 cm→記錄瘤體大小→每3天觀察并記錄瘤體大小→第29天處死大鼠測量腫瘤體積→稱取腫瘤組織進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察體外實(shí)驗(yàn)中MiR-23a靶向HOXC8在腎癌發(fā)生表達(dá)的變化及在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中MiR-23a靶向HOXC8在腎癌發(fā)生表達(dá)的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x-±s）表示，進(jìn)行F檢驗(yàn)，組間比較用t值檢驗(yàn)；采用皮爾森相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性研究，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外實(shí)驗(yàn)中MiR-23a靶向HOXC8在腎癌發(fā)生表達(dá)的變化

在三組腎癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染MiR-23a inhibitor后抑制了細(xì)胞增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，降低了細(xì)胞侵襲性，同時(shí)HOXC8的表達(dá)下調(diào)，MiR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染組HK-2、786-O、CAKI-1、HOXC8均顯著低于空載體轉(zhuǎn)染組及空白組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 三組大鼠肝組織中腎癌細(xì)胞株的表達(dá)比較 （±s）

表1 三組大鼠肝組織中腎癌細(xì)胞株的表達(dá)比較 （±s）

注：t1、P1為MiR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組比較，t2、P2為MiR-23a inhibitor轉(zhuǎn)染組與空白組比較

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2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中MiR-23a靶向HOXC8在腎癌發(fā)生表達(dá)的變化

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染MiR-23a inhibitor后抑制了腫瘤的生長，其機(jī)制與下調(diào)HOXC8的表達(dá)有關(guān)，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 Pearson相關(guān)性分析

3 討論

腎癌是最常見的腎臟惡性腫瘤，早期癥狀不典型，晚期預(yù)后差[4]。近年來，新的證據(jù)顯示一些MiRNA在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[5]。因此，學(xué)術(shù)領(lǐng)域多項(xiàng)研究為了解MiR-23a在腎細(xì)胞癌中的分子機(jī)制，并確定其潛在的臨床價(jià)值，采用流式細(xì)胞術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測MiR-23a在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及其增殖、遷移和凋亡[6]。通過生物信息學(xué)分析、逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription PCR，RTqPCR）、Western Blot和熒光素酶報(bào)告子分析來識(shí)別和檢測MiR-23a與其潛在靶點(diǎn)之間的關(guān)系。相關(guān)研究了118例福爾馬林固定石蠟包埋的RCC標(biāo)本中MiR-23a-3p表達(dá)與臨床病理變量或總生存率（OS）的關(guān)系，RCC細(xì)胞系和TCGA數(shù)據(jù)庫。上調(diào)MiR-23a-3p可增強(qiáng)ACHN和786-O細(xì)胞系中MiR-23a-3p，而沉默MiR-23a-3p則可抑制細(xì)胞活力、增殖和移動(dòng)性[7]。此外，MiR-23a-3p的過度表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡。另據(jù)相關(guān)研究[8]進(jìn)一步揭示MiR-23a-3p通過靶向富含脯氨酸的核受體輔活化子2（proline rich nuclear receptor coactivator，PNRC2）來調(diào)控腫瘤的發(fā)生。cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示MiR-23a-3p低表達(dá)患者的OS顯著延長，該項(xiàng)研究結(jié)果表明MiR-23a-3p不僅可以作為一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物，而且可以作為一種新的治療策略[9]。但是目前顯少見MiR-23a靶向HOXC8在腎癌發(fā)生中的作用及機(jī)制的相關(guān)研究[10]，為了進(jìn)一步證實(shí)MiR-23a靶向HOXC8在腎癌發(fā)生中的作用及機(jī)制，本研究針對(duì)MiR-23a靶向HOXC8的表達(dá)，采取了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，在三組腎癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染MiR-23a inhibitor后抑制的細(xì)胞增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，降低了細(xì)胞侵襲性，同時(shí)HOXC8的表達(dá)也下調(diào)。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染MiR-23a inhibitor后抑制了腫瘤的生長，其機(jī)制與下調(diào)HOXC8的表達(dá)有關(guān)[11]。目前，MiR-23a已被基因芯片分析證實(shí)為多種疾病的致癌基因。然而，MiR-23a作為最常見的腎腫瘤，其在腎癌中的表達(dá)及功能尚不清楚[12]。本研究采用RT-qPCR和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒、Transwell、MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測MiR-23a靶向HOXC8在腎細(xì)胞癌中的作用。研究表明，MiR-23a靶向HOXC8在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯下降。此外，轉(zhuǎn)染MiR-23a inhibitor后抑制了腫瘤的生長，其機(jī)制與下調(diào)HOXC8的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示MiR-23a是腎癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)癌基因，MiR-23a靶向HOXC8的相關(guān)性來看，可能是腎癌的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。