楊杰，黃翠姬，林培嬌，盧宏皓，劉昭明

(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006)

我國(guó)食醋釀造歷史悠久，醋酸菌作為食醋釀造過(guò)程中醋酸發(fā)酵階段的主要菌種，其發(fā)酵性能的優(yōu)劣對(duì)企業(yè)的生產(chǎn)發(fā)展有著極大的影響。在乙酸化過(guò)程中，醋酸菌的活性受許多變量的影響，例如乙酸濃度、乙醇濃度、溶解氧和溫度。現(xiàn)今，我國(guó)食醋釀造工業(yè)中最常用的醋酸菌菌種為巴氏亞種(滬釀1.01)、渾濁變種(中科AS1.41)等，但它們存在一定的發(fā)酵缺陷，不利于生產(chǎn)發(fā)展。因此，選育出高產(chǎn)酸、耐酒精、耐高溫、耐乙酸等性能更強(qiáng)的醋酸菌菌株對(duì)我國(guó)的食醋釀造工業(yè)發(fā)展和醋釀企業(yè)生產(chǎn)都具有很重要的意義[1]。從近幾年來(lái)的文獻(xiàn)資料可以看出，從醋醅中分離篩選出優(yōu)勢(shì)醋酸菌已經(jīng)成為目前醋酸菌研究的熱點(diǎn)之一，如劉陽(yáng)等[2]、陳洋等[3]曾分別從保寧醋曲和工業(yè)醋醅中分離得到產(chǎn)酸量較高、耐受性能較好的醋酸菌，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

廣西民間有著非常豐富的醋醅資源，可以說(shuō)是研究醋酸菌的良好菌種來(lái)源。因此，本研究旨在對(duì)廣西民間釀醋作坊的醋醅進(jìn)行醋酸菌菌種的分離和鑒定，篩選出產(chǎn)酸量較高的醋酸菌，然后對(duì)其發(fā)酵性能進(jìn)行研究，最終篩選出一株產(chǎn)酸量高、溫度耐受能力、酒精耐受能力、乙酸耐受能力等性能較優(yōu)的醋酸菌菌株，以期能夠?yàn)楣I(yè)化醋酸生產(chǎn)和優(yōu)良菌株的選取提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

醋酸菌菌種來(lái)源：廣西民間和工業(yè)釀醋作坊的醋醅。這些醋醅都是在廣西自治區(qū)收集的，將收集的樣品裝入無(wú)菌袋并轉(zhuǎn)移到冰箱(4 ℃)中，在實(shí)驗(yàn)室分析。

革蘭氏染色對(duì)照菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為陽(yáng)性菌株，大腸桿菌(Escherichiacoli)為陰性菌株，均為廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 試劑藥品

葡萄糖、碳酸鈣、無(wú)水乙醇、酚酞指示劑(IND)、氯化鈉、氫氧化鈉、丙三醇、FeCl3·6H2O、鄰苯二甲酸氫鉀：優(yōu)級(jí)純(GR)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、冰乙酸：均為分析純(AR)，西隴化工股份有限公司；酵母膏、瓊脂、瓊脂糖：生化試劑，上海漢尼生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

E220顯微鏡 北京瑞宏誠(chéng)科技發(fā)展有限公司；P3PC紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；DYY-6D電泳儀 北京市六一儀器廠；T100PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)Bio-Rad公司；H3-18KR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：酵母膏1%，葡萄糖1.55%，蒸餾水200 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后在使用前加入3%(V/V)的無(wú)水乙醇。

葡萄糖碳酸鈣培養(yǎng)基(分離培養(yǎng)基)：葡萄糖1.5%，酵母膏1%，瓊脂 2%，pH自然，蒸餾水200 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，滅菌后在培養(yǎng)基溫度降到75 ℃左右加入3%(V/V)的無(wú)水乙醇和1%的無(wú)菌碳酸鈣(165 ℃干熱滅菌 30 min)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏2%，葡萄糖2%，蒸餾水200 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后在使用前加入6%(V/V)的無(wú)水乙醇。

斜面保藏培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，瓊脂2%，丙三醇2.5%，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

產(chǎn)酸培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，使用前加入6%(V/V)的無(wú)水乙醇。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 醋酸菌的分離鑒定

采用平板分離純化培養(yǎng)[4]，在葡萄糖碳酸鈣分離培養(yǎng)基的平板上，產(chǎn)酸的菌株能夠利用底物而生成醋酸，醋酸再與培養(yǎng)基中的CaCO3發(fā)生反應(yīng)從而使CaCO3溶解，所以在產(chǎn)酸的菌株周圍會(huì)形成一個(gè)比較清楚的溶鈣圈，由此可以分離出產(chǎn)酸的細(xì)菌，然后通過(guò)定性試驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定等可以鑒定出篩選得到的菌株屬于哪種菌種。

1.2.1.1 醋醅中菌體富集

配制30 mL種子培養(yǎng)基裝于500 mL錐形瓶中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后無(wú)菌操作加入2 mL醋醅樣品，在30 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)器中振蕩培養(yǎng)24 h，使菌種快速繁殖。

1.2.1.2 稀釋涂布

取1 mL富集好的菌液置于裝有9 mL無(wú)菌生理鹽水的25 mL錐形瓶中，充分混合均勻，此時(shí)菌液濃度為10-1，依次稀釋至10-6，并取 10-4、10-5、10-6樣品稀釋液，分別在平板分離培養(yǎng)基上涂布，每一個(gè)梯度用100 μL稀釋液涂布兩個(gè)平板，涂布完成后在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。

1.2.1.3 平板劃線分離

觀察1.2.1.2中培養(yǎng)好的菌，在單菌落較多、菌落形態(tài)明顯的平板上選取溶鈣圈較大、形態(tài)大小不一的、具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的單菌落進(jìn)行平板劃線分離[5]，純化培養(yǎng)，直至平板上是形態(tài)一致且透明圈清晰的單菌落，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.1.4 斜面保藏培養(yǎng)

將1.2.1.3中純化后的菌株分別取1環(huán)生長(zhǎng)較好的單菌落接種于斜面培養(yǎng)基中，編號(hào)，在培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)24 h后取出，于4 ℃冰箱中保藏。

1.2.1.5 產(chǎn)酸定性試驗(yàn)

將1.2.1.4中的斜面菌株分別取1環(huán)接種于產(chǎn)酸試驗(yàn)培養(yǎng)基中，500 mL錐形瓶裝30 mL培養(yǎng)液，置于30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)器中振蕩培養(yǎng)48 h。取5 mL培養(yǎng)好的菌液，在8000 r/min的條件下離心5 min，然后分別取上清液于試管中，編號(hào)，并用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH至7.0，加入5～6滴10%三氯化鐵溶液(質(zhì)量體積比)，煮沸，若形成紅褐色沉淀說(shuō)明有醋酸產(chǎn)生，則對(duì)應(yīng)菌株判定為產(chǎn)醋酸的細(xì)菌。

1.2.1.6 革蘭氏染色

將1.2.1.4中的斜面菌株取1環(huán)于5 mL種子培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，在搖床中30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。一級(jí)種子培養(yǎng)好后取出，接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的錐形瓶中進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：恒溫?fù)u床中30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。在二級(jí)種子培養(yǎng)到18～24 h時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色，以Bacillussubtilis作陽(yáng)性對(duì)照、Escherichiacoli作陰性對(duì)照，鏡檢并觀察細(xì)胞形態(tài)[6]。

1.2.1.7 初篩

根據(jù)產(chǎn)酸定性試驗(yàn)和革蘭氏染色結(jié)果，篩選出產(chǎn)醋酸且為革蘭氏陰性的菌株，初步判定其為醋酸菌菌株，對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行編號(hào)，并用甘油在-80 ℃條件下保藏菌種。

1.2.1.8 復(fù)篩

采用堿滴定法[7]對(duì)初篩得到的菌株進(jìn)行產(chǎn)酸能力的測(cè)定，棄去產(chǎn)酸能力較弱的菌株，選出產(chǎn)酸能力相對(duì)較強(qiáng)的菌株，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。方法：將斜面菌株進(jìn)行一級(jí)種子、二級(jí)種子培養(yǎng)，在二級(jí)種子培養(yǎng)至18～24 h時(shí)，取10%(體積分?jǐn)?shù))菌液接種于含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板錐形瓶中，置于30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)器中振蕩培養(yǎng)72 h。按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》方法測(cè)定樣品的總酸，以醋酸計(jì)，根據(jù)產(chǎn)酸量的高低來(lái)選擇優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.1.9 16S rDNA鑒定

對(duì)復(fù)篩得到的高產(chǎn)酸菌株進(jìn)行菌種鑒定[8]。取2 μL富集好的菌液于離心管中，用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：ddH2O 19 μL，Master Mix酶25 μL，上游引物27f 2 μL(5′-GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3′),下游引物1492r 2 μL(5′-AACCACATGCTCCACCGCTTG-3′[9])，DNA模板2 μL，混勻，放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序條件見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增程序條件Table 1 PCR amplification program conditions

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶，用無(wú)菌手術(shù)刀切下目的片段，再用通用型DNA純化回收試劑盒進(jìn)行目的片段的純化回收。將純化回收后的目的片段送往生物公司測(cè)序，測(cè)序基因拼接好后將其結(jié)構(gòu)提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列對(duì)比，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,根據(jù)同源性鑒定結(jié)果得出篩選得到的菌株屬于哪種醋酸菌種[10]。

1.2.2 醋酸菌的發(fā)酵特性1.2.2.1 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

一級(jí)種子的培養(yǎng)：將在斜面保藏好的高產(chǎn)酸醋酸菌菌種分別取1環(huán)接種于裝有5 mL種子培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行一級(jí)種子的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：在恒溫振蕩培養(yǎng)器中30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：一級(jí)種子培養(yǎng)好后取出，接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL擋板錐形瓶中進(jìn)行二級(jí)種子的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：在恒溫振蕩培養(yǎng)器中30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)28 h。每隔2 h取一次樣，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線，在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期前用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其活菌數(shù)。

1.2.2.2 溫度耐受能力的測(cè)定

對(duì)篩選得到的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的醋酸菌進(jìn)行溫度耐受能力的測(cè)定[11]。將菌種活化，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期接種于含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板錐形瓶中，菌液接種量為10%(體積分?jǐn)?shù))，分別置于27，30，33，36，39，42 ℃ 6個(gè)不同溫度條件下的恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，每隔12 h取一次樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm下的OD值并按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》方法測(cè)定其醋酸產(chǎn)量，直至穩(wěn)定。

1.2.2.3 酒精耐受能力的測(cè)定

發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌冷卻后分別加入6%、7%、8%、9%、10%、11%、12% (V/V)的無(wú)水乙醇。對(duì)篩選得到的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的醋酸菌進(jìn)行酒精耐受能力試驗(yàn)。將菌種活化，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期接種于含酒精量不同的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板錐形瓶中，菌液接種量為10%(體積分?jǐn)?shù))，置于30 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)，每隔12 h取一次樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm下的OD值并按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》方法測(cè)定其醋酸產(chǎn)量，直至穩(wěn)定。

1.2.2.4 乙酸耐受能力的測(cè)定

按比例配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0%、1%、2%、3%、4%、5%的乙酸。對(duì)篩選得到的產(chǎn)酸能力相對(duì)較強(qiáng)的醋酸菌進(jìn)行乙酸耐受能力測(cè)定。將菌種活化，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期接種于含乙酸量不同的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板錐形瓶中，菌液接種量為10%(體積分?jǐn)?shù))，分別置于30 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)，每隔12 h取一次樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm下的OD值并按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》 方法測(cè)定其醋酸產(chǎn)量，直至穩(wěn)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

除特殊說(shuō)明外，對(duì)每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行2次平行測(cè)定，利用Microsoft Office Excel 2010、Origin 9、MEGA 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和圖譜制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的分離及鑒定

2.1.1 平板初篩菌落形態(tài)

醋醅經(jīng)過(guò)富集后10倍梯度稀釋，涂布平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，平板上的菌落生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。

圖1 平板初篩菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of plate primary screening

從此類型平板上選取溶鈣圈較大、形態(tài)大小不一的5個(gè)單菌落進(jìn)行平板劃線，菌株編號(hào)依次為A1、A2、A3、A4、A5。

2.1.2 產(chǎn)酸定性試驗(yàn)

由于醋醅中微生物的多樣性，所含菌相較為復(fù)雜，平板初篩并不足以判定篩選得到的一定是醋酸菌，因此對(duì)平板初篩得到的5株菌株進(jìn)行產(chǎn)酸定性試驗(yàn)，得到相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 產(chǎn)酸定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The qualitative test results of acid production

由表2可知，A1、A2、A3、A4、A5菌株經(jīng)培養(yǎng)后，菌液中和時(shí)都消耗一定量的氫氧化鈉，能與三氯化鐵共熱生成紅褐色沉淀。其中生成紅褐色沉淀的現(xiàn)象是由于用氫氧化鈉中和菌液后生成了相應(yīng)的鈉鹽，該鈉鹽與三氯化鐵共熱反應(yīng)，生成紅褐色沉淀，表明試驗(yàn)的菌株是能產(chǎn)酸的細(xì)菌，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后產(chǎn)酸使得菌液呈酸性，根據(jù)醋酸菌產(chǎn)酸定性試驗(yàn)的理論依據(jù)，可以初步判斷這5株菌均為醋酸菌。

2.1.3 菌落形態(tài)及革蘭氏染色

經(jīng)過(guò)產(chǎn)酸定性獲得的菌株，其平板菌落形態(tài)見(jiàn)圖2，革蘭氏染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖2可知，各菌株在平板上的菌落形態(tài)為圓形，較小，表面光滑，邊緣整齊，顏色為淺黃色，均符合醋酸菌培養(yǎng)的菌落形態(tài)特征。由圖3可知，通過(guò)革蘭氏染色鏡檢，各個(gè)菌株的細(xì)胞個(gè)體形態(tài)為橢圓或桿狀，有單個(gè)分布、成對(duì)分布和成鏈狀3種排列方式。革蘭氏染色后細(xì)胞被染成紅色，表明該菌為革蘭氏陰性菌，符合醋酸菌的個(gè)體細(xì)胞的形態(tài)特征。綜合以上產(chǎn)酸定性試驗(yàn)及革蘭氏染色結(jié)果，根據(jù)醋酸菌的定義，可判定所得的菌株為醋酸菌。

圖2 平板菌落形態(tài)Fig.2 The colony morphology on plate

圖3 革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 The Gram staining results

2.1.4 菌株產(chǎn)酸能力測(cè)定

將所有試驗(yàn)菌株在含6%的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，采用酸堿滴定法測(cè)定各菌株的產(chǎn)酸情況。由圖4可知，A2菌株的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，為39.9 g/L，其次是A3菌株26.6 g/L和A5菌株21.3 g/L。而 A1菌株和A4菌株的產(chǎn)酸能力很弱，這不利于醋酸發(fā)酵生產(chǎn)，棄去。

圖4 72 h后各菌株產(chǎn)酸情況Fig.4 The acid production of each strain after fermentation for 72 hours

2.2 醋酸菌的發(fā)酵性能測(cè)定

2.2.1 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

由圖5可知，A2菌株在0～6 h時(shí)的生長(zhǎng)曲線較為平緩，此時(shí)菌種生長(zhǎng)緩慢，處于生長(zhǎng)延滯期；在6～24 h，A2菌株的生長(zhǎng)曲線基本呈直線上升趨勢(shì)，此時(shí)菌種生長(zhǎng)繁殖很快，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在24～28 h，A2菌株處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期。A3菌株在0～12 h處于生長(zhǎng)延滯期，在12～24 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在24～28 h處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期。A5菌株在0～10 h處于生長(zhǎng)延滯期，在10～24 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在24～28 h處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期。且由圖5可知，菌株A2的OD600菌體濃度顯著大于菌株A3和A5，說(shuō)明菌株A2的生長(zhǎng)速度高于菌株A3和A5。24 h后菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，且最終菌株A2的菌體濃度明顯高于菌株A3和A5。由此可知在后續(xù)的發(fā)酵試驗(yàn)中，A2菌株應(yīng)選擇在24 h接種發(fā)酵，此時(shí)菌體濃度和活性都是最高的，因此二級(jí)種子培養(yǎng)時(shí)間為24 h[12]。

圖5 各菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curves of each strain

2.2.2 乙醇耐受能力測(cè)定

篩選出的3株產(chǎn)酸較高的醋酸菌在不同乙醇含量下發(fā)酵，其生長(zhǎng)情況及產(chǎn)酸情況見(jiàn)圖6。

圖6 乙醇含量對(duì)菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effect of ethanol content on bacterial biomass and acid production amount注：A為菌體生長(zhǎng)量，B為產(chǎn)酸量。

由圖6可知，在乙醇含量不斷增加的過(guò)程中，各菌株的產(chǎn)酸量均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)生長(zhǎng)量也都有一定抑制。表明高濃度乙醇對(duì)各醋酸菌的生長(zhǎng)均有一定程度的抑制作用，而一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)產(chǎn)醋酸有利[13]。A2菌株在乙醇體積分?jǐn)?shù)為7%時(shí)產(chǎn)酸量最大，為50.6 g/L。A5菌株在乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%時(shí)產(chǎn)酸量達(dá)到最高，為24.9 g/L。A3菌株在乙醇體積分?jǐn)?shù)為9%時(shí)產(chǎn)酸量達(dá)到最高，為26.6 g/L，具有較好的乙醇耐受性。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%以上，所有菌株均受到抑制作用，這可能與乙醇抑制生長(zhǎng)代謝有關(guān)。結(jié)合產(chǎn)酸量和生長(zhǎng)量，綜合分析得出A2菌株有更好的乙醇耐受性。

2.2.3 乙酸耐受能力測(cè)定

篩選出的3株產(chǎn)酸較高的醋酸菌在不同初始乙酸濃度下發(fā)酵，其生長(zhǎng)情況及產(chǎn)酸情況見(jiàn)圖7。

圖7 乙酸含量對(duì)菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.7 Effect of acetic acid content on bacterial biomass and acid production amount注：A為菌體生長(zhǎng)量，B為產(chǎn)酸量。

由圖7可知，在乙酸含量不斷增加的過(guò)程中，3株醋酸菌均受到一定抑制，在乙酸含量為0%和1%的條件下，3株菌均具有較好的生長(zhǎng)量。而A2菌株的產(chǎn)酸量最優(yōu)，為39.9 g/L。隨著酸度逐漸升高，所有醋酸菌的生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量都受到一定的抑制，因?yàn)樗岫冗^(guò)高的環(huán)境會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和相關(guān)酶的活性，故醋酸菌的產(chǎn)酸能力和生長(zhǎng)會(huì)受到抑制[14]?？梢缘贸?，A2菌株在乙酸體積分?jǐn)?shù)為2%以下有較好的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸量。

2.2.4 溫度耐受能力測(cè)定

溫度耐受性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.8 Effect of culture temperature on bacterial biomass and acid production amount注：A為菌體生長(zhǎng)量，B為產(chǎn)酸量。

由圖8可知，在一定的溫度范圍內(nèi)(27～36 ℃)，3株醋酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸均較穩(wěn)定，36～42 ℃時(shí)，所有菌株的生長(zhǎng)均趨于停滯，且產(chǎn)酸量較低。3株醋酸菌的最適宜培養(yǎng)溫度均在30 ℃左右，其中A2菌株的產(chǎn)酸量最高，達(dá)39.9 g/L。A2菌株能耐受36 ℃的溫度，隨著溫度不斷升高，A2菌株的產(chǎn)酸量較為穩(wěn)定。在一定的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，溫度上升有利于醋酸菌的生長(zhǎng)和代謝，而溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致醋酸菌的產(chǎn)酸能力降低，因此產(chǎn)酸下降。綜合分析可知，A2菌株具有更好的溫度耐受性。

2.3 16S rDNA的鑒定

2.3.1 基因片段提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中的條帶見(jiàn)圖9，分別為Marker、A2菌株的瓊脂糖凝膠電泳條帶。

圖9 醋酸菌A2的16S rDNA擴(kuò)增基因片段Fig.9 The 16S rDNA amplified gene fragments of acetic acid bacterium A2

由圖9可知，菌株在1500 bp附近出現(xiàn)亮條帶。用通用型DNA純化回收試劑盒純化回收DNA并提交生物公司測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.3.2 序列分析

醋酸菌A2的16S rDNA核苷酸序列：GCGACGTGTCGGTGCGTCTTGCGGTTCGCTCACCGGCTTAAGGTCAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCACCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGGTTTTTAGAGATCGGCACGATGTCGCCATCTAGCTTCCCACTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGACATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTGTCACCGGCAGTCTCTTTAGAGTGCCCACCCAAACATGCTGGCAACTAAAGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGCAAGAGGTCCCTTGCGGGAAATATCCATCTCTGAATACAGCCTCTCCATACAAGCCCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTGTGCTTATCGCGTTAGCTACGACACTGAGTAACTAAGTTACCCAACATCCAGCACACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTAATGAGCCAGGTTGCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCTTCCCAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTGAGAATTCCACAACCCTCTCTCATACTCTAGTCTGCACGTATCAAATGCAGCTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTGTACAAACCGCCTACACGCCCTTTACGCCCAGTCATTCCGAGCAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTGCGGGTACCGTCATCATCGTCCCCGCCGAAAGTGCTTTACAATCCGAAAACCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTGCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATTGATCATCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACAAGCTAATCAAACGCAGGCTCCTCCACAGGCGACTTGCGCCTTTGACCCTCAGGTATCATGCGGTATTAGCTCCAGTTTCCCGGAGTTATCCCCCACCCATGGATAGATTCCTACGCGTTACTCACCCGTCCGCCACTAAGGCCGAAGCCTTCGTGCGACTGCATGTGTATGAC。

選取菌株A2，對(duì)其16S rDNA基因進(jìn)行部分測(cè)序。利用BLAST比對(duì)核苷酸顯示，菌株A2的序列與Acetobacter屬中編碼為NBRC 14818的AcetobacteracetiNBRC 14818關(guān)系密切，相似度為99%。此外，為了解菌株A2與不同AAB物種之間的關(guān)系，采用Bootstrap分析(1000次重復(fù))構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育鄰位連接樹，見(jiàn)圖10。

圖10 基于16S rDNA基因序列的鄰近連接法研究AAB物種和A2分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 The phylogenetic tree of AAB species and A2 separated strains studied by 16S rDNA gene sequence neighbour-joining method

表3 醋酸菌A2的比對(duì)結(jié)果Table 3 The comparison results of acetic acid bacterium A2

2.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示所篩選的菌株A2與AcetobacteracetiNBRC 14818等3株菌處在同一分支。通過(guò)進(jìn)行BLAST比對(duì)，與參考菌株AcetobacteracetiNBRC 14818的相似度很高[15]。綜合以上分析結(jié)果，得出篩選的A2菌株為醋酸桿菌屬(Acetobacteraceti)，并且命名為醋酸桿菌KDA-2(AcetobacteracetiKDA-2)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以廣西民間釀醋作坊的醋醅為菌種來(lái)源，采用平板分離法，經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩及3個(gè)耐性試驗(yàn)，最后分離篩選出了一株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)以及溫度耐受性能、乙醇耐受性能、乙酸耐受性能較好的醋酸菌KDA-2，其具有潛在的利用價(jià)值。該菌株的優(yōu)良性能具體表現(xiàn)為：在30 ℃、180 r/min、6%乙醇體積分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)3 d醋酸產(chǎn)量可達(dá)39.9 g/L；能耐受36 ℃的溫度，在30 ℃下生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量達(dá)到最大值；能耐受9%(V/V)的乙醇，在7%的乙醇體積分?jǐn)?shù)下產(chǎn)酸量和生長(zhǎng)量達(dá)到最大值；能耐受2%(V/V)的乙酸。