黃永銓 侯秋科 陳善創(chuàng) 劉子桃 劉啟宇 劉軍 江濤*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510006

2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣東 廣州 510006

3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種由于骨強度降低而使骨折風(fēng)險升高的全身性骨骼疾病，骨折是其最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。由于骨結(jié)構(gòu)改變，一旦發(fā)生骨折，將難以獲得較穩(wěn)定的固定，即使采用手術(shù)治療，也會因為骨質(zhì)疏松影響內(nèi)固定的穩(wěn)定性，導(dǎo)致內(nèi)固定失敗、并發(fā)癥增加，康復(fù)時間延長[2]。骨松安膠囊是治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)驗方，在廣東省中醫(yī)院使用20余年，臨床療效肯定，無明顯副作用[3]，但其作用機制尚未明確。Runx 2是成骨細(xì)胞分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子[4]，Osterix處于其下游，且只在骨組織細(xì)胞中表達[5]。研究[6]表明，Runx 2/Osterix途徑是目前在骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)愈合研究中起關(guān)鍵作用的通路。因此，本研究將初步探討骨松安促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合的機制，明確其是否與Runx 2/Osterix途徑相關(guān)，為骨松安的臨床應(yīng)用及進一步試驗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：60只8周齡雌性SPF級SD大鼠，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(粵)2019-0020。將大鼠分為6組，分別是對照組6只，骨質(zhì)疏松組6只，單純骨折組12只，單純骨折+骨松安組12只，骨質(zhì)疏松骨折組12只，骨質(zhì)疏松骨折+骨松安組12只。本研究采用的動物符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，通過動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2骨松安的組成與準(zhǔn)備：骨松安為廣東省中醫(yī)院院內(nèi)制劑(粵藥制字Z20080140)，主要成分為：淫羊藿、當(dāng)歸、鹽山茱萸、澤瀉、鹽杜仲等。功能主治：溫腎健骨，健脾益氣血。臨床用于原發(fā)性或繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的治療。藥物用法用量：溫開水送服，4粒/次，3次/d。使用前采用蒸餾水溶解量為175 mg/mL。

1.2 方法

1.2.1建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型[7]：通過水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取背部雙側(cè)切口，鈍性分離，切除雙側(cè)卵巢后逐層縫合，上述過程嚴(yán)格無菌操作。術(shù)后3 d給予青霉素預(yù)防感染。對照組不切除兩側(cè)卵巢，僅將卵巢周圍的脂肪切除。1個月后行 Micro-CT掃描測量骨密度。

1.2.2Micro-CT掃描：將大鼠放置于Micro-CT (LCT-200，日本Hitachi-Aloka)中進行掃描，電壓50 kV、電流0.5 mAs，分辨率24 μm，掃描角度360 °，獲取連續(xù)的200張斷層圖像，選取感興趣區(qū)域(ROI)通過Latheta軟件進行骨密度、骨體積、相對骨體積等分析。

1.2.3建立骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型[8]：通過水合氯醛將大鼠麻醉，常規(guī)消毒皮膚，取股骨外側(cè)皮膚縱行切口長約3 cm，先暴露髕韌帶，采用10 mL注射器針頭從股骨髁間窩處逆行插入股骨髓腔，然后暴露股外側(cè)肌肌間隙，鈍性分離暴露股骨干中段，行股骨中段橫斷骨折，確定骨折固定穩(wěn)固，傷口清洗，逐層縫合。上述過程嚴(yán)格無菌操作，術(shù)后3 d給予青霉素預(yù)防感染。

1.2.4給藥:單純骨折組(A組)采用蒸餾水灌胃，單純骨折+骨松安組(B組)采用骨松安灌胃，骨質(zhì)疏松骨折組(C組)采用蒸餾水灌胃，骨質(zhì)疏松骨折+骨松安組(D組)采用骨松安灌胃，劑量均為175 mg/kg。每天9、13、17點進行灌胃。采取骨折三期辨證的原則，在用藥后第7、14、21天取大鼠骨折斷端骨痂進行檢測。

1.2.5骨折斷端骨痂HE染色：采用4 %的多聚甲醛對骨折斷端骨痂進行浸泡固定，24 h之后采用20 %的EDTA脫鈣浸泡5周，之后洗滌、脫水、透明、包埋。對組織進行縱行切片，每張厚度為5 μm，切片脫蠟、水化、蘇木精染細(xì)胞核，鹽酸及乙醇分化、伊紅染細(xì)胞漿，再透明脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察骨痂的形態(tài)學(xué)情況。

1.2.6免疫組化檢測骨折斷端Runx 2、Osterix的表達：上述切片脫蠟之后，用過氧化氫將內(nèi)源性過氧化物封閉，加入復(fù)合消化液，孵育20 min并洗滌之后一抗Runx 2、Osterix孵育過夜，第二天洗滌之后，滴入生物素化羊抗兔二抗，洗滌之后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，洗滌、透明、封片之后，觀察細(xì)胞染色情況。當(dāng)細(xì)胞核顯示為棕黃色染色時，即為陽性細(xì)胞。采用Olympus BX63顯微鏡對圖像進行采集，并采用自帶軟件系統(tǒng)計算出陽性細(xì)胞比例。

1.2.7RT-qPCR檢測骨折端Runx 2、Osterix的表達：各組骨痂組織于4 ℃上研磨，按照Trizol 試劑說明書提取骨痂標(biāo)本總RNA。RT-PCR制備cDNA，反應(yīng)總體積20 μL，RNA模板量2 μg。引物設(shè)計：GAPDH上游：5′-GCAAGGATA CTGAGAGCAAGAG-3′，下游：5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGATG-3′；Osterix上游： 5′-CCAATGACTACCCACCCTTTC-3′，下游：5′-TAGGCAGGCAGTCAGAAGA-3′；Runx 2上游：5′-GGACCGACACAGCCATATAAA-3′ ，下游：5′-GCCTCATTCCCTAACCTGAAA-3′。PCR反應(yīng)、擴增條件參考文獻[8]。采用熒光染料技術(shù)進行實時定量 PCR反應(yīng)，獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析CT值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析，SNK法進行兩兩比較，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松癥造模后骨密度比較

造模后，骨質(zhì)疏松組皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨以及總體骨密度均較對照組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05，見表1)。上述結(jié)果表明骨質(zhì)疏松癥大鼠造模成功。

表1 骨質(zhì)疏松癥造模后骨密度比較

2.2 骨痂組織形態(tài)觀察

7 d時，B組與D組骨折端可見大量的軟骨細(xì)胞在形成的纖維肉芽組織中，軟骨內(nèi)可見軟骨內(nèi)骨化，軟骨基質(zhì)形成，可見膜內(nèi)化骨現(xiàn)象，股間隙之間可見纖維肉芽組織增生，骨膜增厚，大片軟骨細(xì)胞形成，可見新生骨組織，成骨細(xì)胞可見聚集現(xiàn)象。C組與A折組均可見纖維組織增多，可見散在、少量的軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞，雖然骨膜有增厚，但新生骨組織較少;14 d時，B組與D組纖維性骨痂減少，軟骨痂增多并轉(zhuǎn)化為編織骨。A、C組軟骨痂較少，未見編織骨形成；21 d時，B組與D組骨折間隙編織骨逐漸聚集，骨痂呈連續(xù)性，骨小梁骨量逐漸增加，C組與A組僅有大量軟骨細(xì)胞形成，骨小梁形成較少，只有散在、少量編織骨。見圖1。

圖1 骨痂組織形態(tài)觀察(100 ×)

2.3 骨松安治療后骨折端Runx 2表達比較

治療7 d時進行比較，除C組外，其余三組均可見Runx 2表達明顯，以B組最為顯著，D組與A組比較，無明顯差異；治療14 d時比較，四組大鼠骨折端Runx 2的表達均較前有所增加，但C組增加較少，D組與B組表達增加較為明顯；治療21 d時，四組大鼠骨折端Runx 2的表達較前進一步增加，D組與B組較A組與C組明顯。上述結(jié)果表明，骨松安可上調(diào)骨折端Runx 2的表達，促進成骨細(xì)胞的早期未成熟分化，加速骨折愈合。見圖2。陽性細(xì)胞統(tǒng)計見圖5A。

圖2 骨松安治療后骨折端Runx 2表達比較(100 ×)

2.4 骨松安治療后骨折端Osterix表達比較

治療7 d時進行比較，B組較A組Osterix的表達更為明顯，D組較C組Osterix的表達更為明顯；治療14 d時比較，四組大鼠骨折端Osterix的表達均有所增加，但C組增加較少，D組與B組增加較為明顯；治療21 d時，B組、D組Osterix的表達繼續(xù)增加，A組與C組Osterix的表達趨于穩(wěn)定。上述結(jié)果表明，骨松安可上調(diào)骨折端Osterix的表達，促進未成熟的成骨細(xì)胞進一步成熟分化，加速骨折愈合。見圖3。陽性細(xì)胞統(tǒng)計見圖5B。

圖3 骨松安治療后骨折端Osterix表達比較(100 ×)

圖4 骨松安治療后骨折端Runx 2、Osterix mRNA表達比較

圖5 骨松安治療后骨折端Runx 2、Osterix 陽性細(xì)胞數(shù)比較

2.5 骨松安治療后骨折端Runx 2、Osterix mRNA表達比較

Runx 2與Osterix mRNA的表達表現(xiàn)出與免疫組化相同的趨勢，即Runx 2與Osterix在7、14、21 d均表達增加，在骨松安的治療下，無論是單純骨折大鼠，還是骨質(zhì)疏松骨折大鼠，Runx 2與Osterix的表達都較為顯著。相反，無骨松安治療，到21 d時，Runx 2與Osterix的表達趨于穩(wěn)定，與14 d時比較，差異不明顯。上述結(jié)果表明，骨松安可上調(diào)骨折端Runx 2、Osterix的表達，促進前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，加速骨折愈合。見圖4。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”，發(fā)病關(guān)鍵是腎虛，腎中精氣隨著年齡的增長是一個由盛轉(zhuǎn)衰的過程，腎精不足則骨骼失養(yǎng)，造成骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[9]。研究[10]認(rèn)為，“腎虛”的本質(zhì)是下丘腦-垂體軸發(fā)生了紊亂，即腦信號影響激素內(nèi)分泌水平進而引起成骨密度下降，而補腎中藥可糾正其紊亂、改善下丘腦-垂體-性腺軸的功能，調(diào)整體內(nèi)性激素環(huán)境，提高骨量，促進骨折愈合。骨松安膠囊是治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)驗方，在廣東省中醫(yī)院使用20余年，臨床療效肯定，無明顯副作用[3]。方中重用骨碎補與補骨脂共為君藥，具有補腎壯骨的作用；另用北芪取其益氣助血行之功，丹參善通行血脈、活血化瘀，淫羊藿善補腎陽、強筋骨，共為臣藥；續(xù)斷具有補腎舒經(jīng)通絡(luò)之效，可引藥下行，作為使藥；全方配伍發(fā)揮補腎壯骨，活血通絡(luò)之效。中醫(yī)用藥講究配伍和“君、臣、佐、使”，用現(xiàn)代醫(yī)藥的觀點來看是多種藥物聯(lián)合作用，具有多靶點、協(xié)同作用的功效，但治療骨質(zhì)疏松癥的確切分子機制尚未明確。

Runx 2是Runx家族的轉(zhuǎn)錄因子，其表達主要限于成骨細(xì)胞和間充質(zhì)形成骨骼、軟骨和牙齒過程中[11-13]。因此，Runx 2是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞分化、軟骨細(xì)胞成熟、骨形成和重塑中起核心作用。而且，它是影響骨骼生物學(xué)的機械信號的關(guān)鍵靶標(biāo)[14]。目前發(fā)現(xiàn)Runx 2能調(diào)控骨鈣素、Ⅰ型膠原、骨涎蛋白和骨橋蛋白等成骨相關(guān)基因[15-16]。Runx 2突變會導(dǎo)致骨骼的發(fā)育、生長異常[17]。研究[18]亦發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松骨折大鼠局部組織Runx 2的表達水平比正常大鼠降低，骨折愈合較慢。

Osterix也稱Sp7，是另一個重要的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子[19-20]。Osterix只在骨組織細(xì)胞中表達，是成骨細(xì)胞分化和骨形成所必需的[5]。早在2002年，Nakashima等[20]就發(fā)現(xiàn)Osterix缺失的小鼠可表達正常水平的Runx 2，但在Runx 2缺失小鼠中并無Osterix的表達，Runx 2與之結(jié)合后可上調(diào)Osterix啟動子活性，說明Osterix是Runx 2的下游基因。研究發(fā)現(xiàn)[6]Runx 2可在成骨分化的早期階段促進骨基質(zhì)蛋白的形成，但只會停留在早期階段，不能進一步分化，說明Runx 2的作用是促進成骨細(xì)胞的早期未成熟分化。而敲除未成熟成骨細(xì)胞中的Osterix后，其無法發(fā)育為成熟的成骨細(xì)胞，也就是說成骨細(xì)胞的最終成熟分化由Osterix主導(dǎo)。上述研究基礎(chǔ)表明Runx 2/Osterix在成骨細(xì)胞分化和骨形成中起著關(guān)鍵作用，骨松安治療骨質(zhì)疏松癥的具體分子機制必然與之相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，骨松安治療可早期促進軟骨細(xì)胞增生、成骨細(xì)胞成熟分化及編織骨形成，與未經(jīng)骨松安治療比較，差異顯著。在骨松安治療7、14、21 d時，無論是正常大鼠還是骨質(zhì)疏松大鼠，Runx 2與Osterix的表達均持續(xù)上升，與既往研究結(jié)果相符。相反，未經(jīng)骨松安治療時，Runx 2與Osterix的表達在同樣時間段內(nèi)表達較少，到21 d時，Runx 2與Osterix的表達趨于穩(wěn)定，與14 d時比較，差異不明顯。值得注意的是，骨質(zhì)疏松性骨折組大鼠Runx 2與Osterix的表達一直處于較低水平，可能與骨質(zhì)疏松造模后，Runx 2與Osterix的表達受到抑制有關(guān)。上述結(jié)果表明，骨松安可上調(diào)骨折端Runx 2、Osterix的表達，促進前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，加速骨折愈合。

綜上，骨松安可激活Runx 2/Osterix途徑，加速前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的骨折愈合。但本研究仍存在一定的局限性，如對于骨松安中起作用的有效成分尚未明確。同時，僅明確了與Runx 2/Osterix途徑相關(guān)，但對其具體作用機制未進行更深入的研究。骨折愈合機制復(fù)雜，且中藥的調(diào)控存在多靶點、多途徑、多層次的特點，因此尚需進一步的研究對其進行探索。