樊薰勤 張明勇 李雯婷 錢雪豐 徐寧路 王勇 曹平 張杰 郭奉斌 趙志強 鄭金鵬 劉盾 劉拴*

1.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430064

2.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院放射介入科，湖北 武漢 430064

sox-9基因在軟骨細胞的發(fā)育和肥大軟骨細胞的變化中起著重要作用，可調(diào)節(jié)生長[1]。關(guān)節(jié)軟骨受到損傷時，很難完成自身修復(fù)，且尚無有效方法能產(chǎn)生具有正常功能的透明軟骨組織，其治療方案一直是骨科領(lǐng)域的難題之一。干細胞是一類處于“不成熟”和未分化狀態(tài)的細胞，具有很強的自我更新能力和多向分化潛能。研究發(fā)現(xiàn)[2]，調(diào)節(jié)sox-9基因表達，可將脂肪源性干細胞誘導(dǎo)分化為功能性軟骨細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化能力在骨相關(guān)疾病的治療中具有潛在的臨床應(yīng)用價值[3]。但由于病理性骨組織可影響MSCs的成骨分化和遷移能力，從而限制了MSCs移植治療的效果[4]。在MSCs成骨分化過程中，sox-9和聚集蛋白聚糖等軟骨生成標志物的含量升高[5]。sox-9在MSCs分化成軟骨細胞的過程中起著關(guān)鍵性作用，sox-9可與collageⅡ、aggrecan等基因的增強子元件相結(jié)合，促進collageⅡ和aggercan等基因的表達，從而促使MSCs向軟骨方向分化[6-7]。因此，本研究以BMSCs為研究對象，以sox-9為靶基因，探索sox-9表達對BMSCs分化的影響，以期為軟骨損傷修復(fù)的基因強化組織工程治療手段奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

4周齡的SD大鼠，購自湖北省疾病控制中心。

1.2 試劑及儀器

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；0.25%胰蛋白酶、CCK8溶液、正常兔血清(Solarbio，中國)；CD90-FITC、CD34-FITC熒光標記抗體(eBioscience，美國)；慢病毒sox-9 shRNA(上海吉凱基因科技有限公司，中國)；腺病毒Ad-GFP和Ad-sox-9-PLCG2(漢恒生物科技有限公司，中國)；甲醛、30% H2O2(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，中國)；CollageⅡ、Aggrecan、sox-9、Wnt3a、β-catenin抗體(Abcam，英國)；HRP免疫組化試劑盒、生物素標記的抗山羊IgG、DAB濃縮型試劑盒、蘇木精、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液(Bioswamp，中國)；GAPDH(CST，美國)。主要儀器：流式細胞儀(BECKMAN公司，美國)；倒置顯微鏡(Leica公司，德國)；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(天能源科技有限公司，中國)。

1.3 BMSCs的分離和鑒定

1.3.1BMSCs的分離：4周齡的SD大鼠頸椎脫臼處死后，于75%的乙醇溶液中浸泡消毒10 min。超凈工作臺內(nèi)，取下雙側(cè)股骨及脛骨并剔除附著肌肉，兩端剪除少許骨骺端，暴露骨髓腔，無菌PBS反復(fù)沖洗，將骨髓細胞過篩網(wǎng)制成單細胞懸液，離心后，棄上清，加入少量含10%胎牛血清的DMEM重懸并接種于培養(yǎng)皿。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24 h后全量換液，2 d后去除非貼壁細胞，以后每3 d換液1次，待細胞達80%～90%融合時，0.25%胰酶消化并進行傳代，利用差速貼壁特性逐步純化BMSCs。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化；流式細胞術(shù)鑒定表面抗原CD90和CD45的表達。

1.3.2BMSCs的鑒定：倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及貼壁狀況，并拍照記錄。表面標志物檢測第3代BMSCs，胰蛋白酶室溫消化，離心收集細胞，PBS清洗細胞并制成單細胞懸液。各樣本分別加入抗CD90和CD45的熒光標記抗體，同時設(shè)立同型陰性對照，4 ℃避光孵育，用流式細胞儀進行檢測。

1.4 細胞分組和處理

將細胞分為空白對照組(con)、過表達對照組(ov-NC組)、干擾對照組(sh-NC組)、sox-9過表達組(ov-sox-9組)、sox-9干擾組(sh-sox-9組)5組。慢病毒sox-9 shRNA由上海吉凱基因科技有限公司合成鑒定，腺病毒Ad-GFP和Ad-sox-9-PLCG2由漢恒生物科技有限公司合成鑒定，sox-9過表達組(ov-sox-9組)和sox-9干擾組(sh-sox-9組)BMSCs分別感染Ad-sox-9-PLCG2腺病毒和sox-9 shRNA慢病毒。

1.5 BMSCs生長曲線分析

取生長狀態(tài)良好的第3代BMSCs，以4×103/mL接種于96孔板，每組6復(fù)孔，每3 d換液1次，采用CCK8法檢測其生長增殖能力。培養(yǎng)3、7、14 d時，在相應(yīng)復(fù)孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃孵育4 h，酶標儀檢測490 nm波長處各孔光密度值(OD值)，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線。

1.6 免疫組化

取細胞玻片經(jīng)4%多聚甲醛固定。細胞玻片依次經(jīng)3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶15 min，PBS沖洗，10%正常兔血清封閉非特異性結(jié)合30 min，滴加1∶100的抗CollageⅡ、Aggrecan多克隆山羊抗體于濕盒內(nèi)4 ℃過夜，PBS沖洗，滴加1∶100生物素標記的抗山羊IgG孵育15 min，PBS沖洗，辣根酶標記鏈霉卵白素孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot檢測

誘導(dǎo)分化后，Western blot檢測BMSCs中sox-9、Wnt3a、β-catenin等指標的表達變化。冰面上RIPA蛋白裂解液裂解細胞，每5 min振蕩1次，裂解20 min，4 ℃下15 000 r/min離心30 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳2.5 h，轉(zhuǎn)膜后NC膜TBS稍蕩洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃下分別孵育sox-9、Wnt3a、β-catenin一抗過夜，TBST洗10 min，重復(fù)3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗10 min，重復(fù)3次，曝光顯影；采用BIO-RAD Image Lab軟件進行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細胞鑒定

細胞鑒定結(jié)果見圖1。細胞形態(tài)見圖1 A，細胞呈纖維狀。表面抗原鑒定見圖1B，其結(jié)果表明細胞表面抗原CD90呈陽性，CD45呈陰性。

圖1 細胞形態(tài)觀察(A)和表面抗原表達檢測(B)

2.2 sox-9對BMSCs增殖的影響

BMSCs在sox-9修飾后培養(yǎng)3～14 d的增殖變化見圖2。在各個時間點，各組之間的增殖能力無顯著差異(P>0.05)。

圖2 CCK8檢測BMSCs的增殖活性

2.3 sox-9促進BMSCs的分化

免疫組化檢測CollageⅡ、Aggrecan表達見圖3。與對照組或NC組比較，ov-sox-9組的CollageⅡ和Aggrecan陽性表達水平升高，sh-sox-9組的CollageⅡ和Aggrecan表達水平降低。

圖3 免疫組化檢測CollageⅡ和Aggrecan表達

2.4 sox-9抑制Wnt3a和β-catenin的表達

Western blot檢測結(jié)果見圖4，和對照組比較，sh-NC組和ov-NC組均無顯著性差異(P>0.05)。和對照組或NC組比較，ov-sox-9組的sox-9表達顯著升高，Wnt3a和β-catenin的表達顯著降低(P<0.05)，sh-sox-9組sox-9表達顯著降低，Wnt3a和β-catenin的表達顯著升高(P<0.05)。

圖4 Western blot檢測sox-9、Wnt3a和β-catenin蛋白表達水平

3 討論

軟骨組織在骨骼的構(gòu)建、保護和補充中起著關(guān)鍵作用，然而，由于缺少血液供應(yīng)，軟骨受到損傷后一般難以自我修復(fù)，通常會引起后續(xù)的一系列病變，成為骨科疾病治療的難點[8-9]。軟骨由軟骨細胞精心構(gòu)建和維護，因此研究可促進BMSCs分化為軟骨細胞的調(diào)節(jié)因子將有利于研發(fā)軟骨損傷的治療方案。研究表明位于人17號染色體上的sox-9基因是軟骨發(fā)育的關(guān)鍵基因，在軟骨的分化過程中有著重要影響，其突變可導(dǎo)致骨骼畸形綜合征[10-11]。本研究以BMSCs為研究對象，探討sox-9對BMSCs向軟骨細胞分化能力的影響。

本研究首先探究了sox-9基因?qū)D45陰性CD90陽性BMSCs增殖能力的影響。其結(jié)果顯示，sox-9基因的過表達和抑制未對BMSCs增殖能力產(chǎn)生顯著性影響。隨后通過研究Collage Ⅱ、Aggrecan蛋白的表達情況判斷sox-9基因的修飾對BMSCs分化能力的影響。作為軟骨細胞大量產(chǎn)生的軟骨細胞外基質(zhì)，Collage Ⅱ和Aggrecan蛋白可用于指示軟骨細胞的分化水平[8，12]，其結(jié)果顯示上調(diào)sox-9基因的表達可顯著促進軟骨細胞的形成。sox-9基因修飾對軟骨形成的影響與之前的研究結(jié)論相似[13]，其作用方式不是通過增強細胞增殖能力而提供更多可供分化為軟骨細胞的BMSCs。

根據(jù)sox-9基因的上調(diào)促進BMSCs軟骨分化的研究成果，繼續(xù)深入研究其調(diào)控的途徑。Wnt/β-catenin信號通路的抑制已被證明可促進BMSCs成軟骨分化[14-15]，且有研究表明Wnt/β-catenin信號通路可通過抑制sox-9基因的表達來抑制軟骨形成并促進成骨分化[16]。Chen等[17]證明了可通過sox-9基因的上調(diào)表達抑制GSK-3β的磷酸化作用，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路。相關(guān)研究[13]表明，Wnt3a/β-catenin信號通路可影響間質(zhì)細胞向成骨細胞和軟骨細胞分化的平衡。在本研究結(jié)果中，上調(diào)sox-9基因可抑制BMSCs中Wnt3a和β-catenin的表達，而下調(diào)sox-9基因可促進BMSCs中Wnt3a和β-catenin的表達，提示sox-9基因可負調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路。

綜上所述，上調(diào)sox-9基因的表達，對BMSCs增殖無明顯作用，但可促進Collage Ⅱ和Aggrecan的表達，說明sox-9基因?qū)MSCs向軟骨細胞分化過程具有調(diào)控作用，其作用機制可能與抑制Wnt3a/β-catenin信號通路有關(guān)。