樊薰勤 張明勇 李雯婷 錢雪豐 徐寧路 王勇 曹平 張杰 郭奉斌 趙志強(qiáng) 鄭金鵬 劉盾 劉拴*

1.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430064

2.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院放射介入科，湖北 武漢 430064

sox-9基因在軟骨細(xì)胞的發(fā)育和肥大軟骨細(xì)胞的變化中起著重要作用，可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)[1]。關(guān)節(jié)軟骨受到損傷時(shí)，很難完成自身修復(fù)，且尚無有效方法能產(chǎn)生具有正常功能的透明軟骨組織，其治療方案一直是骨科領(lǐng)域的難題之一。干細(xì)胞是一類處于“不成熟”和未分化狀態(tài)的細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能。研究發(fā)現(xiàn)[2]，調(diào)節(jié)sox-9基因表達(dá)，可將脂肪源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為功能性軟骨細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化能力在骨相關(guān)疾病的治療中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[3]。但由于病理性骨組織可影響MSCs的成骨分化和遷移能力，從而限制了MSCs移植治療的效果[4]。在MSCs成骨分化過程中，sox-9和聚集蛋白聚糖等軟骨生成標(biāo)志物的含量升高[5]。sox-9在MSCs分化成軟骨細(xì)胞的過程中起著關(guān)鍵性作用，sox-9可與collageⅡ、aggrecan等基因的增強(qiáng)子元件相結(jié)合，促進(jìn)collageⅡ和aggercan等基因的表達(dá)，從而促使MSCs向軟骨方向分化[6-7]。因此，本研究以BMSCs為研究對(duì)象，以sox-9為靶基因，探索sox-9表達(dá)對(duì)BMSCs分化的影響，以期為軟骨損傷修復(fù)的基因強(qiáng)化組織工程治療手段奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

4周齡的SD大鼠，購(gòu)自湖北省疾病控制中心。

1.2 試劑及儀器

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))；胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))；0.25%胰蛋白酶、CCK8溶液、正常兔血清(Solarbio，中國(guó))；CD90-FITC、CD34-FITC熒光標(biāo)記抗體(eBioscience，美國(guó))；慢病毒sox-9 shRNA(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，中國(guó))；腺病毒Ad-GFP和Ad-sox-9-PLCG2(漢恒生物科技有限公司，中國(guó))；甲醛、30% H2O2(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))；CollageⅡ、Aggrecan、sox-9、Wnt3a、β-catenin抗體(Abcam，英國(guó))；HRP免疫組化試劑盒、生物素標(biāo)記的抗山羊IgG、DAB濃縮型試劑盒、蘇木精、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液(Bioswamp，中國(guó))；GAPDH(CST，美國(guó))。主要儀器：流式細(xì)胞儀(BECKMAN公司，美國(guó))；倒置顯微鏡(Leica公司，德國(guó))；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(天能源科技有限公司，中國(guó))。

1.3 BMSCs的分離和鑒定

1.3.1BMSCs的分離：4周齡的SD大鼠頸椎脫臼處死后，于75%的乙醇溶液中浸泡消毒10 min。超凈工作臺(tái)內(nèi)，取下雙側(cè)股骨及脛骨并剔除附著肌肉，兩端剪除少許骨骺端，暴露骨髓腔，無菌PBS反復(fù)沖洗，將骨髓細(xì)胞過篩網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，離心后，棄上清，加入少量含10%胎牛血清的DMEM重懸并接種于培養(yǎng)皿。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24 h后全量換液，2 d后去除非貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液1次，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，0.25%胰酶消化并進(jìn)行傳代，利用差速貼壁特性逐步純化BMSCs。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)鑒定表面抗原CD90和CD45的表達(dá)。

1.3.2BMSCs的鑒定：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁狀況，并拍照記錄。表面標(biāo)志物檢測(cè)第3代BMSCs，胰蛋白酶室溫消化，離心收集細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液。各樣本分別加入抗CD90和CD45的熒光標(biāo)記抗體，同時(shí)設(shè)立同型陰性對(duì)照，4 ℃避光孵育，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞分組和處理

將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(con)、過表達(dá)對(duì)照組(ov-NC組)、干擾對(duì)照組(sh-NC組)、sox-9過表達(dá)組(ov-sox-9組)、sox-9干擾組(sh-sox-9組)5組。慢病毒sox-9 shRNA由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司合成鑒定，腺病毒Ad-GFP和Ad-sox-9-PLCG2由漢恒生物科技有限公司合成鑒定，sox-9過表達(dá)組(ov-sox-9組)和sox-9干擾組(sh-sox-9組)BMSCs分別感染Ad-sox-9-PLCG2腺病毒和sox-9 shRNA慢病毒。

1.5 BMSCs生長(zhǎng)曲線分析

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs，以4×103/mL接種于96孔板，每組6復(fù)孔，每3 d換液1次，采用CCK8法檢測(cè)其生長(zhǎng)增殖能力。培養(yǎng)3、7、14 d時(shí)，在相應(yīng)復(fù)孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔光密度值(OD值)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 免疫組化

取細(xì)胞玻片經(jīng)4%多聚甲醛固定。細(xì)胞玻片依次經(jīng)3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶15 min，PBS沖洗，10%正常兔血清封閉非特異性結(jié)合30 min，滴加1∶100的抗CollageⅡ、Aggrecan多克隆山羊抗體于濕盒內(nèi)4 ℃過夜，PBS沖洗，滴加1∶100生物素標(biāo)記的抗山羊IgG孵育15 min，PBS沖洗，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot檢測(cè)

誘導(dǎo)分化后，Western blot檢測(cè)BMSCs中sox-9、Wnt3a、β-catenin等指標(biāo)的表達(dá)變化。冰面上RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，每5 min振蕩1次，裂解20 min，4 ℃下15 000 r/min離心30 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳2.5 h，轉(zhuǎn)膜后NC膜TBS稍蕩洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃下分別孵育sox-9、Wnt3a、β-catenin一抗過夜，TBST洗10 min，重復(fù)3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗10 min，重復(fù)3次，曝光顯影；采用BIO-RAD Image Lab軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定

細(xì)胞鑒定結(jié)果見圖1。細(xì)胞形態(tài)見圖1 A，細(xì)胞呈纖維狀。表面抗原鑒定見圖1B，其結(jié)果表明細(xì)胞表面抗原CD90呈陽(yáng)性，CD45呈陰性。

圖1 細(xì)胞形態(tài)觀察(A)和表面抗原表達(dá)檢測(cè)(B)

2.2 sox-9對(duì)BMSCs增殖的影響

BMSCs在sox-9修飾后培養(yǎng)3～14 d的增殖變化見圖2。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組之間的增殖能力無顯著差異(P>0.05)。

圖2 CCK8檢測(cè)BMSCs的增殖活性

2.3 sox-9促進(jìn)BMSCs的分化

免疫組化檢測(cè)CollageⅡ、Aggrecan表達(dá)見圖3。與對(duì)照組或NC組比較，ov-sox-9組的CollageⅡ和Aggrecan陽(yáng)性表達(dá)水平升高，sh-sox-9組的CollageⅡ和Aggrecan表達(dá)水平降低。

圖3 免疫組化檢測(cè)CollageⅡ和Aggrecan表達(dá)

2.4 sox-9抑制Wnt3a和β-catenin的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖4，和對(duì)照組比較，sh-NC組和ov-NC組均無顯著性差異(P>0.05)。和對(duì)照組或NC組比較，ov-sox-9組的sox-9表達(dá)顯著升高，Wnt3a和β-catenin的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，sh-sox-9組sox-9表達(dá)顯著降低，Wnt3a和β-catenin的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

圖4 Western blot檢測(cè)sox-9、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平

3 討論

軟骨組織在骨骼的構(gòu)建、保護(hù)和補(bǔ)充中起著關(guān)鍵作用，然而，由于缺少血液供應(yīng)，軟骨受到損傷后一般難以自我修復(fù)，通常會(huì)引起后續(xù)的一系列病變，成為骨科疾病治療的難點(diǎn)[8-9]。軟骨由軟骨細(xì)胞精心構(gòu)建和維護(hù)，因此研究可促進(jìn)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子將有利于研發(fā)軟骨損傷的治療方案。研究表明位于人17號(hào)染色體上的sox-9基因是軟骨發(fā)育的關(guān)鍵基因，在軟骨的分化過程中有著重要影響，其突變可導(dǎo)致骨骼畸形綜合征[10-11]。本研究以BMSCs為研究對(duì)象，探討sox-9對(duì)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化能力的影響。

本研究首先探究了sox-9基因?qū)D45陰性CD90陽(yáng)性BMSCs增殖能力的影響。其結(jié)果顯示，sox-9基因的過表達(dá)和抑制未對(duì)BMSCs增殖能力產(chǎn)生顯著性影響。隨后通過研究Collage Ⅱ、Aggrecan蛋白的表達(dá)情況判斷sox-9基因的修飾對(duì)BMSCs分化能力的影響。作為軟骨細(xì)胞大量產(chǎn)生的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，Collage Ⅱ和Aggrecan蛋白可用于指示軟骨細(xì)胞的分化水平[8，12]，其結(jié)果顯示上調(diào)sox-9基因的表達(dá)可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的形成。sox-9基因修飾對(duì)軟骨形成的影響與之前的研究結(jié)論相似[13]，其作用方式不是通過增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力而提供更多可供分化為軟骨細(xì)胞的BMSCs。

根據(jù)sox-9基因的上調(diào)促進(jìn)BMSCs軟骨分化的研究成果，繼續(xù)深入研究其調(diào)控的途徑。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制已被證明可促進(jìn)BMSCs成軟骨分化[14-15]，且有研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過抑制sox-9基因的表達(dá)來抑制軟骨形成并促進(jìn)成骨分化[16]。Chen等[17]證明了可通過sox-9基因的上調(diào)表達(dá)抑制GSK-3β的磷酸化作用，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。相關(guān)研究[13]表明，Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路可影響間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的平衡。在本研究結(jié)果中，上調(diào)sox-9基因可抑制BMSCs中Wnt3a和β-catenin的表達(dá)，而下調(diào)sox-9基因可促進(jìn)BMSCs中Wnt3a和β-catenin的表達(dá)，提示sox-9基因可負(fù)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述，上調(diào)sox-9基因的表達(dá)，對(duì)BMSCs增殖無明顯作用，但可促進(jìn)Collage Ⅱ和Aggrecan的表達(dá)，說明sox-9基因?qū)MSCs向軟骨細(xì)胞分化過程具有調(diào)控作用，其作用機(jī)制可能與抑制Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。